中山大学学报（医学科学版）
中山大學學報（醫學科學版）
중산대학학보（의학과학판）
JOURNAL OF SUN YAT-SEN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)
2006年
4期
361-364
,共4页
张若霜%帅丽芳%赵勇%陈系古
張若霜%帥麗芳%趙勇%陳繫古
장약상%수려방%조용%진계고
四环素调控系统%tTS沉默子%诱导表达%HepG2细胞
四環素調控繫統%tTS沉默子%誘導錶達%HepG2細胞
사배소조공계통%tTS침묵자%유도표체%HepG2세포
[目的]构建带有肝脏特异性启动子和tTS沉默子的四环素调控系统,观察其在人HepG2细胞内的表达,建立严密型四环素调控系统的HepG2细胞模型.[方法]通过二次分子克隆构建重组真核表达质粒载体pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂质体法将质粒pliv7-rtTA-tTS-Neo及pliv7-rtTA-Neo转染人HepG2细胞,经G418筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化,克隆扩增后瞬时转染pTRE-Luc质粒,强力霉素(1 mg/L)诱导表达后检测荧光素酶活性,挑选出低背景和高诱导表达的HepG2细胞克隆.[结果]带有tTS的细胞株其诱导倍数明显高于不带有tTS的细胞株(192:21),其中克隆9的诱导倍数最高(256),获得1株高表达、低背景的HepG2/pLiv7-rtTA-tTS-Neo细胞株.[结论]荧光素酶活性检测结果验证了tTS对四环素调控系统的内在泄露问题有一定的抑制作用,使四环素调控系统的开关具有真正意义上的严密性.
[目的]構建帶有肝髒特異性啟動子和tTS沉默子的四環素調控繫統,觀察其在人HepG2細胞內的錶達,建立嚴密型四環素調控繫統的HepG2細胞模型.[方法]通過二次分子剋隆構建重組真覈錶達質粒載體pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂質體法將質粒pliv7-rtTA-tTS-Neo及pliv7-rtTA-Neo轉染人HepG2細胞,經G418篩選後的剋隆用有限稀釋法進行單剋隆化,剋隆擴增後瞬時轉染pTRE-Luc質粒,彊力黴素(1 mg/L)誘導錶達後檢測熒光素酶活性,挑選齣低揹景和高誘導錶達的HepG2細胞剋隆.[結果]帶有tTS的細胞株其誘導倍數明顯高于不帶有tTS的細胞株(192:21),其中剋隆9的誘導倍數最高(256),穫得1株高錶達、低揹景的HepG2/pLiv7-rtTA-tTS-Neo細胞株.[結論]熒光素酶活性檢測結果驗證瞭tTS對四環素調控繫統的內在洩露問題有一定的抑製作用,使四環素調控繫統的開關具有真正意義上的嚴密性.
[목적]구건대유간장특이성계동자화tTS침묵자적사배소조공계통,관찰기재인HepG2세포내적표체,건립엄밀형사배소조공계통적HepG2세포모형.[방법]통과이차분자극륭구건중조진핵표체질립재체pliv7-rtTA-tTS-Neo,용지질체법장질립pliv7-rtTA-tTS-Neo급pliv7-rtTA-Neo전염인HepG2세포,경G418사선후적극륭용유한희석법진행단극륭화,극륭확증후순시전염pTRE-Luc질립,강력매소(1 mg/L)유도표체후검측형광소매활성,도선출저배경화고유도표체적HepG2세포극륭.[결과]대유tTS적세포주기유도배수명현고우불대유tTS적세포주(192:21),기중극륭9적유도배수최고(256),획득1주고표체、저배경적HepG2/pLiv7-rtTA-tTS-Neo세포주.[결론]형광소매활성검측결과험증료tTS대사배소조공계통적내재설로문제유일정적억제작용,사사배소조공계통적개관구유진정의의상적엄밀성.
