CAJ | 학술논문

目的:应用Tet-On基因表达系统构建可调控性真核表达质粒,实现Mac-1-FP在CHO细胞中的可调控性表达.方法:采用DNA重组技术构建真核表达质粒pTRE-Tight-CFP-CD11b和pTRE-Tight-YFP-CD18(CD11b和CD18是Mac-1的两个亚基),通过脂质体介导共转染CHO细胞,用荧光显微镜观察转染后阳性细胞;应用RT-PCR和荧光强度分析观察不同浓度(0、0.01、0.1、0.5、1、2 μg/ml)强力霉素(Dox)对细胞内CD11b和CD18表达水平的影响;检测PMA(1 μg/ml)刺激前后CHO-Mac-1-FP细胞与其配基ICAM-1黏附活性的变化.结果:酶切鉴定和测序证实,已成功构建真核表达质粒pTRE-Tight-CFP-CD11b和pTRE-Tight-YFP-CD18,在荧光显微镜下观察到转染成功的CHO细胞发出青色荧光和黄色荧光.通过荧光显微镜观察到随着培养液中Dox浓度的增加,CHO细胞内的荧光强度相应增强,同时CD11b和CD18在mRNA水平的表达也随Dox浓度的增加而增加.PMA刺激后,CHO-Mac-1-FP细胞与其配基ICAM-1黏附率增高(2 h和4 h时最高,此后逐渐下降).结论:本研究成功实现了Mac-1-FP在CHO细胞中的可调控性表达并具有野生型Mac-1的黏附活性,为进一步开展单分子光谱(SMS)和荧光共振能量转移(FRET)技术研究活细胞内Mac-1分子的2个亚基的二聚化、群集、构象及与配基亲和力变化创造条件.
목적:응용Tet-On기인표체계통구건가조공성진핵표체질립,실현Mac-1-FP재CHO세포중적가조공성표체.방법:채용DNA중조기술구건진핵표체질립pTRE-Tight-CFP-CD11b화pTRE-Tight-YFP-CD18(CD11b화CD18시Mac-1적량개아기),통과지질체개도공전염CHO세포,용형광현미경관찰전염후양성세포;응용RT-PCR화형광강도분석관찰불동농도(0、0.01、0.1、0.5、1、2 μg/ml)강력매소(Dox)대세포내CD11b화CD18표체수평적영향;검측PMA(1 μg/ml)자격전후CHO-Mac-1-FP세포여기배기ICAM-1점부활성적변화.결과:매절감정화측서증실,이성공구건진핵표체질립pTRE-Tight-CFP-CD11b화pTRE-Tight-YFP-CD18,재형광현미경하관찰도전염성공적CHO세포발출청색형광화황색형광.통과형광현미경관찰도수착배양액중Dox농도적증가,CHO세포내적형광강도상응증강,동시CD11b화CD18재mRNA수평적표체야수Dox농도적증가이증가.PMA자격후,CHO-Mac-1-FP세포여기배기ICAM-1점부솔증고(2 h화4 h시최고,차후축점하강).결론:본연구성공실현료Mac-1-FP재CHO세포중적가조공성표체병구유야생형Mac-1적점부활성,위진일보개전단분자광보(SMS)화형광공진능량전이(FRET)기술연구활세포내Mac-1분자적2개아기적이취화、군집、구상급여배기친화력변화창조조건.