畜牧市场
畜牧市場
축목시장
STOCKBREEDLNDG MARKET
2009年
10期
21-23
,共3页
余晓岚%肖少波%方六荣%金梅林%陈焕春
餘曉嵐%肖少波%方六榮%金梅林%陳煥春
여효람%초소파%방륙영%금매림%진환춘
牛疱疹病毒Ⅰ型%ul49基因%克隆%序列分析%表达
牛皰疹病毒Ⅰ型%ul49基因%剋隆%序列分析%錶達
우포진병독Ⅰ형%ul49기인%극륭%서렬분석%표체
以牛疤疹病毒Ⅰ型(BHV-Ⅰ)国内地方分离株感染的细胞培养物制备PCR模板,扩增出大小约0.77kb的u149基因完整编码区片段,将扩增片段克隆到pMD18-T载体中,获得含u149基因的重组质粒pMD-VP22.采用双脱氧末端终止法进行序列测定,发现与国外Cooper株u14g基因序列完全一致,说明u149基因相当保守.进一步将BHV-Ⅰu149完整编码区片段插入原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C1中,获得分别与6xHis融合的原核表达质粒pET-28aVP22和与EGFP融合的真核表达质粒pEGFPVP22.将pET-28aVP22转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测发现在38kDa处有一条特异性的表达带.利用脂质体介导,将pEGFPVP22转染PK-15细胞,经G418加压筛选,获得稳定表达VP22的细胞克隆.在倒置荧光显微镜直接检测未固定的活细胞,发现pEGFPVP22转染细胞能发出很强的荧光并主要集中在细胞核中,而对照载体pEGFP-C1转染细胞的荧光分布于胞浆.
以牛疤疹病毒Ⅰ型(BHV-Ⅰ)國內地方分離株感染的細胞培養物製備PCR模闆,擴增齣大小約0.77kb的u149基因完整編碼區片段,將擴增片段剋隆到pMD18-T載體中,穫得含u149基因的重組質粒pMD-VP22.採用雙脫氧末耑終止法進行序列測定,髮現與國外Cooper株u14g基因序列完全一緻,說明u149基因相噹保守.進一步將BHV-Ⅰu149完整編碼區片段插入原覈錶達載體pET-28a和真覈錶達載體pEGFP-C1中,穫得分彆與6xHis融閤的原覈錶達質粒pET-28aVP22和與EGFP融閤的真覈錶達質粒pEGFPVP22.將pET-28aVP22轉化大腸桿菌BL21(DE3),經IPTG誘導,SDS-PAGE電泳檢測髮現在38kDa處有一條特異性的錶達帶.利用脂質體介導,將pEGFPVP22轉染PK-15細胞,經G418加壓篩選,穫得穩定錶達VP22的細胞剋隆.在倒置熒光顯微鏡直接檢測未固定的活細胞,髮現pEGFPVP22轉染細胞能髮齣很彊的熒光併主要集中在細胞覈中,而對照載體pEGFP-C1轉染細胞的熒光分佈于胞漿.
이우파진병독Ⅰ형(BHV-Ⅰ)국내지방분리주감염적세포배양물제비PCR모판,확증출대소약0.77kb적u149기인완정편마구편단,장확증편단극륭도pMD18-T재체중,획득함u149기인적중조질립pMD-VP22.채용쌍탈양말단종지법진행서렬측정,발현여국외Cooper주u14g기인서렬완전일치,설명u149기인상당보수.진일보장BHV-Ⅰu149완정편마구편단삽입원핵표체재체pET-28a화진핵표체재체pEGFP-C1중,획득분별여6xHis융합적원핵표체질립pET-28aVP22화여EGFP융합적진핵표체질립pEGFPVP22.장pET-28aVP22전화대장간균BL21(DE3),경IPTG유도,SDS-PAGE전영검측발현재38kDa처유일조특이성적표체대.이용지질체개도,장pEGFPVP22전염PK-15세포,경G418가압사선,획득은정표체VP22적세포극륭.재도치형광현미경직접검측미고정적활세포,발현pEGFPVP22전염세포능발출흔강적형광병주요집중재세포핵중,이대조재체pEGFP-C1전염세포적형광분포우포장.
