南京农业大学学报
南京農業大學學報
남경농업대학학보
JOURNAL OF NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY
2007年
4期
114-119
,共6页
苏鑫铭%徐亚林%于春梅%曹瑞兵%周斌%陈溥言
囌鑫銘%徐亞林%于春梅%曹瑞兵%週斌%陳溥言
소흠명%서아림%우춘매%조서병%주빈%진부언
伪狂犬病病毒%PCR%Cre重组酶%真核细胞系%loxP
偽狂犬病病毒%PCR%Cre重組酶%真覈細胞繫%loxP
위광견병병독%PCR%Cre중조매%진핵세포계%loxP
根据Cre基因序列设计并合成1对引物,PCR扩增出Cre基因编码区,克隆于pIREShyg载体,得到重组质粒pIREShyg-Cre,转染HEK-293A细胞后经400 μg·mL-1 Hygromycin B的筛选,将其中1个阳性克隆命名为293A-Cre.利用伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)S03109株(带有gfp报告基因表达盒及loxP位点)感染293A-Cre细胞,荧光显微镜观察、PCR及Western blot检测gfp基因的表达.结果表明,S03109感染293A-Cre二代后loxP位点间的gfp表达盒被删除,获得重组病毒S0419.将S0419感染已转染pBlulox的293A-Cre细胞,在RK13细胞上筛选得到表达LacZ的重组病毒S06293.S06293在293A-Cre细胞上传代2次,X-Gal原位染色表明LacZ的表达消失.测序结果证实,在Cre重组酶作用下,2个同向loxP序列之间的外源基因序列被正确除去.以上结果表明,本研究构建的稳定表达Cre重组酶的293A-Cre细胞系可以用于在包含有loxP位点的PRV基因组中外源基因的快速删除或整合.
根據Cre基因序列設計併閤成1對引物,PCR擴增齣Cre基因編碼區,剋隆于pIREShyg載體,得到重組質粒pIREShyg-Cre,轉染HEK-293A細胞後經400 μg·mL-1 Hygromycin B的篩選,將其中1箇暘性剋隆命名為293A-Cre.利用偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)S03109株(帶有gfp報告基因錶達盒及loxP位點)感染293A-Cre細胞,熒光顯微鏡觀察、PCR及Western blot檢測gfp基因的錶達.結果錶明,S03109感染293A-Cre二代後loxP位點間的gfp錶達盒被刪除,穫得重組病毒S0419.將S0419感染已轉染pBlulox的293A-Cre細胞,在RK13細胞上篩選得到錶達LacZ的重組病毒S06293.S06293在293A-Cre細胞上傳代2次,X-Gal原位染色錶明LacZ的錶達消失.測序結果證實,在Cre重組酶作用下,2箇同嚮loxP序列之間的外源基因序列被正確除去.以上結果錶明,本研究構建的穩定錶達Cre重組酶的293A-Cre細胞繫可以用于在包含有loxP位點的PRV基因組中外源基因的快速刪除或整閤.
근거Cre기인서렬설계병합성1대인물,PCR확증출Cre기인편마구,극륭우pIREShyg재체,득도중조질립pIREShyg-Cre,전염HEK-293A세포후경400 μg·mL-1 Hygromycin B적사선,장기중1개양성극륭명명위293A-Cre.이용위광견병병독(Pseudorabies virus,PRV)S03109주(대유gfp보고기인표체합급loxP위점)감염293A-Cre세포,형광현미경관찰、PCR급Western blot검측gfp기인적표체.결과표명,S03109감염293A-Cre이대후loxP위점간적gfp표체합피산제,획득중조병독S0419.장S0419감염이전염pBlulox적293A-Cre세포,재RK13세포상사선득도표체LacZ적중조병독S06293.S06293재293A-Cre세포상전대2차,X-Gal원위염색표명LacZ적표체소실.측서결과증실,재Cre중조매작용하,2개동향loxP서렬지간적외원기인서렬피정학제거.이상결과표명,본연구구건적은정표체Cre중조매적293A-Cre세포계가이용우재포함유loxP위점적PRV기인조중외원기인적쾌속산제혹정합.
