CAJ | 학술논문

目的构建携带天花粉蛋白基因的高效表达载体,对比原核表达的重组天花粉蛋白和天然蛋白的免疫原性.方法通过RT-PCR技术扩增无N端和C端序列的TCS基因,测序鉴定后克隆入表达载体pET-29b中,IPTG诱导表达.用金属螯合层析法纯化重组蛋白.薄层扫描及Bradford法检测纯化后重组蛋白的纯度和含量.间接ELISA法检测重组蛋白和天然蛋白产生的多克隆抗体效价.Western blotting检测重组蛋白与抗天然蛋白抗体之间的免疫反应性.结果 1.双酶切鉴定结果表明,pET-29b-TCS成功构建;2.30℃,1 mmol/L的IPTG诱导4 h,重组蛋白的表达量最高(占细菌总蛋白量的36%),主要以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中;3.His-tag特异性结合树脂纯化后,获得了纯度达95%的重组蛋白,纯化后的蛋白含量为1.2 g/L;4.间接ELISA法检测天然蛋白和重组蛋白产生的抗体效价分别为1:4 960和1:5 120;5.Western blotting测纯化的重组蛋白与抗天然蛋白的多克隆抗体之间有特异反应性.结论本实验成功构建了高效表达载体pET-29b-TCS,携带的天花粉蛋白基因无N端和C端编码序列.重组蛋白的抗体效价显著低于天然蛋白,表明天然蛋白的糖基化与其免疫原性之间有一定的关系.
목적구건휴대천화분단백기인적고효표체재체,대비원핵표체적중조천화분단백화천연단백적면역원성.방법통과RT-PCR기술확증무N단화C단서렬적TCS기인,측서감정후극륭입표체재체pET-29b중,IPTG유도표체.용금속오합층석법순화중조단백.박층소묘급Bradford법검측순화후중조단백적순도화함량.간접ELISA법검측중조단백화천연단백산생적다극륭항체효개.Western blotting검측중조단백여항천연단백항체지간적면역반응성.결과 1.쌍매절감정결과표명,pET-29b-TCS성공구건;2.30℃,1 mmol/L적IPTG유도4 h,중조단백적표체량최고(점세균총단백량적36%),주요이가용성비포함체형식존재우포장중;3.His-tag특이성결합수지순화후,획득료순도체95%적중조단백,순화후적단백함량위1.2 g/L;4.간접ELISA법검측천연단백화중조단백산생적항체효개분별위1:4 960화1:5 120;5.Western blotting측순화적중조단백여항천연단백적다극륭항체지간유특이반응성.결론본실험성공구건료고효표체재체pET-29b-TCS,휴대적천화분단백기인무N단화C단편마서렬.중조단백적항체효개현저저우천연단백,표명천연단백적당기화여기면역원성지간유일정적관계.