CAJ | 학술논문

背景:有研究者发现激活细胞外信号调节激酶的上游激酶-细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)途径并没有促神经元存活的作用,还有一些研究者发现激活该信号通路不仅不能对细胞起到保护作用,反而可促进细胞死亡.目的:实验拟观察体外培养神经元急性缺氧损伤中ERK1/2通路在脑源性神经营养因子抗缺氧损伤中的作用.设计、时间及地点:随机对照分组设计,于2005-03/2006-04在华西医院移植工程及移植免疫实验室完成.材料:孕17～19d的SD雌鼠,清洁级,体质量350～400g; ERK1/2特异性阻滞剂U0126购自Calbiochem公司;脑源性神经营养因子购自R&D公司.方法:体外培养孕17～19d的胚鼠大脑皮质神经元,7d后作缺氧培养,并随机分为5组,缺氧组:单纯神经元缺氧培养;脑源性神经营养因子组:缺氧培养前30min加入脑源性神经营养因子50μg/L; U0126组:缺氧培养前1h加入10μmol/L的U0126; U0126+脑源性神经营养因子组:缺氧培养前1h加入10μmol/L的U0126,30min后加入50μg/L脑源性神经营养因子;基线对照组:不做缺氧培养也不加入任何物质.主要观察指标:采用四甲基偶氮唑盐法检测0～8h内各组之间细胞存活率的差别;蛋白免疫印迹检测.0～6h内各组神经元ERK1/2和磷酸化ERK1/2、 cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element-binding protein, CREB)和磷酸化CREB的表达变化.结果:①脑源性神经营养因子组神经元活性在缺氧后各时间点显著高于缺氧组(P＜0.01); U0126+脑源性神经营养因子组细胞活性在缺氧后各时间点显著低于脑源性神经营养因子组(P＜0.01).②外源性脑源性神经营养因子对总ERK和总CREB的表达无影响,但可显著增加磷酸化ERK和磷酸化CREB的表达;U0126对总ERK表达无影响,但可显著抑制脑源性神经营养因子作用后磷酸化ERK的上调,同时U0126也可明显抑制脑源性神经营养因子介导的磷酸化CREB的表达.结论:阻滞ERK1/2传递后脑源性神经营养因子对缺氧神经元的保护作用迅速降低,提示ERK1/2是体外培养神经元缺氧损伤中脑源性神经营养因子保护作用的重要途径. 揹景:有研究者髮現激活細胞外信號調節激酶的上遊激酶-細胞外信號調節激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)途徑併沒有促神經元存活的作用,還有一些研究者髮現激活該信號通路不僅不能對細胞起到保護作用,反而可促進細胞死亡.目的:實驗擬觀察體外培養神經元急性缺氧損傷中ERK1/2通路在腦源性神經營養因子抗缺氧損傷中的作用.設計、時間及地點:隨機對照分組設計,于2005-03/2006-04在華西醫院移植工程及移植免疫實驗室完成.材料:孕17～19d的SD雌鼠,清潔級,體質量350～400g; ERK1/2特異性阻滯劑U0126購自Calbiochem公司;腦源性神經營養因子購自R&D公司.方法:體外培養孕17～19d的胚鼠大腦皮質神經元,7d後作缺氧培養,併隨機分為5組,缺氧組:單純神經元缺氧培養;腦源性神經營養因子組:缺氧培養前30min加入腦源性神經營養因子50μg/L; U0126組:缺氧培養前1h加入10μmol/L的U0126; U0126+腦源性神經營養因子組:缺氧培養前1h加入10μmol/L的U0126,30min後加入50μg/L腦源性神經營養因子;基線對照組:不做缺氧培養也不加入任何物質.主要觀察指標:採用四甲基偶氮唑鹽法檢測0～8h內各組之間細胞存活率的差彆;蛋白免疫印跡檢測.0～6h內各組神經元ERK1/2和燐痠化ERK1/2、 cAMP反應元件結閤蛋白(cAMP responsive element-binding protein, CREB)和燐痠化CREB的錶達變化.結果:①腦源性神經營養因子組神經元活性在缺氧後各時間點顯著高于缺氧組(P＜0.01); U0126+腦源性神經營養因子組細胞活性在缺氧後各時間點顯著低于腦源性神經營養因子組(P＜0.01).②外源性腦源性神經營養因子對總ERK和總CREB的錶達無影響,但可顯著增加燐痠化ERK和燐痠化CREB的錶達;U0126對總ERK錶達無影響,但可顯著抑製腦源性神經營養因子作用後燐痠化ERK的上調,同時U0126也可明顯抑製腦源性神經營養因子介導的燐痠化CREB的錶達.結論:阻滯ERK1/2傳遞後腦源性神經營養因子對缺氧神經元的保護作用迅速降低,提示ERK1/2是體外培養神經元缺氧損傷中腦源性神經營養因子保護作用的重要途徑.
배경:유연구자발현격활세포외신호조절격매적상유격매-세포외신호조절격매(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)도경병몰유촉신경원존활적작용,환유일사연구자발현격활해신호통로불부불능대세포기도보호작용,반이가촉진세포사망.목적:실험의관찰체외배양신경원급성결양손상중ERK1/2통로재뇌원성신경영양인자항결양손상중적작용.설계、시간급지점:수궤대조분조설계,우2005-03/2006-04재화서의원이식공정급이식면역실험실완성.재료:잉17～19d적SD자서,청길급,체질량350～400g; ERK1/2특이성조체제U0126구자Calbiochem공사;뇌원성신경영양인자구자R&D공사.방법:체외배양잉17～19d적배서대뇌피질신경원,7d후작결양배양,병수궤분위5조,결양조:단순신경원결양배양;뇌원성신경영양인자조:결양배양전30min가입뇌원성신경영양인자50μg/L; U0126조:결양배양전1h가입10μmol/L적U0126; U0126+뇌원성신경영양인자조:결양배양전1h가입10μmol/L적U0126,30min후가입50μg/L뇌원성신경영양인자;기선대조조:불주결양배양야불가입임하물질.주요관찰지표:채용사갑기우담서염법검측0～8h내각조지간세포존활솔적차별;단백면역인적검측.0～6h내각조신경원ERK1/2화린산화ERK1/2、 cAMP반응원건결합단백(cAMP responsive element-binding protein, CREB)화린산화CREB적표체변화.결과:①뇌원성신경영양인자조신경원활성재결양후각시간점현저고우결양조(P＜0.01); U0126+뇌원성신경영양인자조세포활성재결양후각시간점현저저우뇌원성신경영양인자조(P＜0.01).②외원성뇌원성신경영양인자대총ERK화총CREB적표체무영향,단가현저증가린산화ERK화린산화CREB적표체;U0126대총ERK표체무영향,단가현저억제뇌원성신경영양인자작용후린산화ERK적상조,동시U0126야가명현억제뇌원성신경영양인자개도적린산화CREB적표체.결론:조체ERK1/2전체후뇌원성신경영양인자대결양신경원적보호작용신속강저,제시ERK1/2시체외배양신경원결양손상중뇌원성신경영양인자보호작용적중요도경.