中国人兽共患病杂志
中國人獸共患病雜誌
중국인수공환병잡지
CHINESE JOURNAL OF ZOONOSES
2004年
12期
1052-1057
,共6页
张咏莉%余新炳%吴德%吴忠道%毕惠祥%陈明志
張詠莉%餘新炳%吳德%吳忠道%畢惠祥%陳明誌
장영리%여신병%오덕%오충도%필혜상%진명지
华支睾吸虫%RPEF基因%重组质粒克隆%原核表达%免疫印迹
華支睪吸蟲%RPEF基因%重組質粒剋隆%原覈錶達%免疫印跡
화지고흡충%RPEF기인%중조질립극륭%원핵표체%면역인적
目的构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因重组质粒,分析其编码序列,并进行大肠杆菌原核重组表达和免疫鉴定. 方法根据RPEF基因已知序列设计一对引物,用常规PCR技术从华支睾吸虫质粒文库模板中扩增RPEF基因片段;将目的基因PCR产物和空质粒pGEX-4T-1同时用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切,纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL21.将构建的重组质粒pGEX-4T-1-RPEF双酶切、PCR、测序鉴定正确后在BL21中诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western-blot方法鉴定其原核表达效果. 结果成功构建出RPEF基因原核重组质粒pGEX-4T-1-RPEF.SDS-PAGE分析显示RPEF基因在大肠杆菌BL21系统中得以高效表达,其融合蛋白分子量大约45kD,与理论值相符.Western-blot的结果显示此RPEF融合蛋白可被山羊GST单抗所识别,融合蛋白具有GST免疫反应性.结论筛选到华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因,并成功构建原核表达载体及在E.coliBL21系统中高效表达.
目的構建華支睪吸蟲成蟲RNA聚閤酶Ⅱ延長因子(RPEF)基因重組質粒,分析其編碼序列,併進行大腸桿菌原覈重組錶達和免疫鑒定. 方法根據RPEF基因已知序列設計一對引物,用常規PCR技術從華支睪吸蟲質粒文庫模闆中擴增RPEF基因片段;將目的基因PCR產物和空質粒pGEX-4T-1同時用BamHⅠ和SalⅠ限製性內切酶雙酶切,純化迴收後建立連接反應併轉化大腸桿菌BL21.將構建的重組質粒pGEX-4T-1-RPEF雙酶切、PCR、測序鑒定正確後在BL21中誘導錶達,SDS-PAGE電泳和Western-blot方法鑒定其原覈錶達效果. 結果成功構建齣RPEF基因原覈重組質粒pGEX-4T-1-RPEF.SDS-PAGE分析顯示RPEF基因在大腸桿菌BL21繫統中得以高效錶達,其融閤蛋白分子量大約45kD,與理論值相符.Western-blot的結果顯示此RPEF融閤蛋白可被山羊GST單抗所識彆,融閤蛋白具有GST免疫反應性.結論篩選到華支睪吸蟲RNA聚閤酶Ⅱ延長因子(RPEF)基因,併成功構建原覈錶達載體及在E.coliBL21繫統中高效錶達.
목적구건화지고흡충성충RNA취합매Ⅱ연장인자(RPEF)기인중조질립,분석기편마서렬,병진행대장간균원핵중조표체화면역감정. 방법근거RPEF기인이지서렬설계일대인물,용상규PCR기술종화지고흡충질립문고모판중확증RPEF기인편단;장목적기인PCR산물화공질립pGEX-4T-1동시용BamHⅠ화SalⅠ한제성내절매쌍매절,순화회수후건립련접반응병전화대장간균BL21.장구건적중조질립pGEX-4T-1-RPEF쌍매절、PCR、측서감정정학후재BL21중유도표체,SDS-PAGE전영화Western-blot방법감정기원핵표체효과. 결과성공구건출RPEF기인원핵중조질립pGEX-4T-1-RPEF.SDS-PAGE분석현시RPEF기인재대장간균BL21계통중득이고효표체,기융합단백분자량대약45kD,여이론치상부.Western-blot적결과현시차RPEF융합단백가피산양GST단항소식별,융합단백구유GST면역반응성.결론사선도화지고흡충RNA취합매Ⅱ연장인자(RPEF)기인,병성공구건원핵표체재체급재E.coliBL21계통중고효표체.
