农业生物技术学报
農業生物技術學報
농업생물기술학보
JOURNAL OF AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY
2008年
2期
208-213
,共6页
牛IFN-т%克隆%原核表达%生物活性
牛IFN-т%剋隆%原覈錶達%生物活性
우IFN-т%극륭%원핵표체%생물활성
采用PCR方法直接从牛早期胚胎细胞中扩增牛干扰素-tau(bovine interferon-tau,bIFN-т)基因,并克隆到pGEM-T载体中.然后将含信号肽和不含信号肽的bIFN-т片段分别与原核表达载体pET-30a(+)连接.并用IPTG诱导表达.重组蛋白经Ni2+亲合层析纯化后,通过抗病毒检测和对靶细胞形态变化的影响检验其生物学功能.实验结果显示,以胚胎裂解液为模板、不提取胚胎基因组DNA,可以从少量(5枚)的牛囊胚中直接扩增出bIFN-т基因,与GenBank(XM-593584)序列相比,核苷酸和氨基酸的同源性分别为99%和97%;不含信号肽序列的重组质粒诱导表达后,经SDS-PAGE电泳检测发现约在20 kD处出现特异性蛋白条带,与目标蛋白分子量一致;纯化后重组蛋白的抗病毒活性单位为1×104IU/mg;在牛子宫内膜上皮细胞培养液中添加2.9ìg/mL纯化的rbIFN-т蛋白后24 h,细胞体积明显增大,细胞内出现囊泡状结构.表明实验获得了具有一定生物活性的rbIFN-т蛋白.
採用PCR方法直接從牛早期胚胎細胞中擴增牛榦擾素-tau(bovine interferon-tau,bIFN-т)基因,併剋隆到pGEM-T載體中.然後將含信號肽和不含信號肽的bIFN-т片段分彆與原覈錶達載體pET-30a(+)連接.併用IPTG誘導錶達.重組蛋白經Ni2+親閤層析純化後,通過抗病毒檢測和對靶細胞形態變化的影響檢驗其生物學功能.實驗結果顯示,以胚胎裂解液為模闆、不提取胚胎基因組DNA,可以從少量(5枚)的牛囊胚中直接擴增齣bIFN-т基因,與GenBank(XM-593584)序列相比,覈苷痠和氨基痠的同源性分彆為99%和97%;不含信號肽序列的重組質粒誘導錶達後,經SDS-PAGE電泳檢測髮現約在20 kD處齣現特異性蛋白條帶,與目標蛋白分子量一緻;純化後重組蛋白的抗病毒活性單位為1×104IU/mg;在牛子宮內膜上皮細胞培養液中添加2.9ìg/mL純化的rbIFN-т蛋白後24 h,細胞體積明顯增大,細胞內齣現囊泡狀結構.錶明實驗穫得瞭具有一定生物活性的rbIFN-т蛋白.
채용PCR방법직접종우조기배태세포중확증우간우소-tau(bovine interferon-tau,bIFN-т)기인,병극륭도pGEM-T재체중.연후장함신호태화불함신호태적bIFN-т편단분별여원핵표체재체pET-30a(+)련접.병용IPTG유도표체.중조단백경Ni2+친합층석순화후,통과항병독검측화대파세포형태변화적영향검험기생물학공능.실험결과현시,이배태렬해액위모판、불제취배태기인조DNA,가이종소량(5매)적우낭배중직접확증출bIFN-т기인,여GenBank(XM-593584)서렬상비,핵감산화안기산적동원성분별위99%화97%;불함신호태서렬적중조질립유도표체후,경SDS-PAGE전영검측발현약재20 kD처출현특이성단백조대,여목표단백분자량일치;순화후중조단백적항병독활성단위위1×104IU/mg;재우자궁내막상피세포배양액중첨가2.9ìg/mL순화적rbIFN-т단백후24 h,세포체적명현증대,세포내출현낭포상결구.표명실험획득료구유일정생물활성적rbIFN-т단백.
