CAJ | 학술논문

用RT-PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,Enterokinase Light Chain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn-Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6 mg EKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx-hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1:100时,经37℃保温5 h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.
용RT-PCR확증장격매경련(EKLC,Enterokinase Light Chain)적cDNA,병극륭지효모분비형표체질립pPICZαA중.장중조질립pPICZαA/EKLC전화지표체숙주pichia pastoris GS115,경갑순유도,목표단백EKLC표체병분비지효모배양기중.채용Zn-Sepharose친화층석일보순화,종매승배양액가획득1.6 mg EKLC,기순도체90%이상.매반응동역학결과표명,EKLC대소분자저물Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamide적Km위(753±42)mol/L,kcat위(31.5±3.8)s-1.대류양화환원단백-뇌납소융합단백(Trx-hBNP)적매해작용현시,당매여저물중량비대우1:100시,경37℃보온5 h후,초과75%적융합단백피렬해.상술결과표명,EKLC능구특이식별병수해Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-태건,시일충능장융합단백중목표단백여재체단백렬해석방적유효공구매.