重庆医学
重慶醫學
중경의학
CHONGQING MEDICAL JOURNAL
2012年
17期
1716-1718
,共3页
赵四敏%陈旭东%赵国强%董子明
趙四敏%陳旭東%趙國彊%董子明
조사민%진욱동%조국강%동자명
突变型DNA聚合酶β%pcDNA4-C真核表达载体%EC 9706细胞
突變型DNA聚閤酶β%pcDNA4-C真覈錶達載體%EC 9706細胞
돌변형DNA취합매β%pcDNA4-C진핵표체재체%EC 9706세포
目的 构建含食管癌突变型DNA聚合酶β基因(DNA polymerase β,polβ)的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,使其在polβ基因敲除的EC9706细胞中表达.方法 根据食管癌突变型polβ基因序列,设计并合成一对特异性引物(引物1、引物2),通过PCR扩增获得含BamHⅠ和ApaⅠ的基因序列,将其克隆入T载体,PCR及测序鉴定无误后,将其插入真核表达载体pcDNA4-C,从而构建了含突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ.将重组质粒以脂质体包裹的方式转染入polβ基因敲除的EC 9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.结果 经过PCR筛选及 DNA测序鉴定,证实真核表达载体pcDNA4-C-polβ构建成功.筛选后的EC 9706细胞经HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化,仅在39 kD位置有一条带,证明蛋白表达及纯化成功.结论 成功构建了食管癌突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,并纯化出polβ蛋白,为进一步研究polβ的功能奠定坚实的基础.
目的 構建含食管癌突變型DNA聚閤酶β基因(DNA polymerase β,polβ)的真覈錶達載體pcDNA4-C-polβ,使其在polβ基因敲除的EC9706細胞中錶達.方法 根據食管癌突變型polβ基因序列,設計併閤成一對特異性引物(引物1、引物2),通過PCR擴增穫得含BamHⅠ和ApaⅠ的基因序列,將其剋隆入T載體,PCR及測序鑒定無誤後,將其插入真覈錶達載體pcDNA4-C,從而構建瞭含突變型polβ基因的真覈錶達載體pcDNA4-C-polβ.將重組質粒以脂質體包裹的方式轉染入polβ基因敲除的EC 9706細胞,G418篩選穫得穩定轉染的細胞株.結果 經過PCR篩選及 DNA測序鑒定,證實真覈錶達載體pcDNA4-C-polβ構建成功.篩選後的EC 9706細胞經HislinkTM蛋白純化試劑盒純化,僅在39 kD位置有一條帶,證明蛋白錶達及純化成功.結論 成功構建瞭食管癌突變型polβ基因的真覈錶達載體pcDNA4-C-polβ,併純化齣polβ蛋白,為進一步研究polβ的功能奠定堅實的基礎.
목적 구건함식관암돌변형DNA취합매β기인(DNA polymerase β,polβ)적진핵표체재체pcDNA4-C-polβ,사기재polβ기인고제적EC9706세포중표체.방법 근거식관암돌변형polβ기인서렬,설계병합성일대특이성인물(인물1、인물2),통과PCR확증획득함BamHⅠ화ApaⅠ적기인서렬,장기극륭입T재체,PCR급측서감정무오후,장기삽입진핵표체재체pcDNA4-C,종이구건료함돌변형polβ기인적진핵표체재체pcDNA4-C-polβ.장중조질립이지질체포과적방식전염입polβ기인고제적EC 9706세포,G418사선획득은정전염적세포주.결과 경과PCR사선급 DNA측서감정,증실진핵표체재체pcDNA4-C-polβ구건성공.사선후적EC 9706세포경HislinkTM단백순화시제합순화,부재39 kD위치유일조대,증명단백표체급순화성공.결론 성공구건료식관암돌변형polβ기인적진핵표체재체pcDNA4-C-polβ,병순화출polβ단백,위진일보연구polβ적공능전정견실적기출.
