华中科技大学学报(医学版)
華中科技大學學報(醫學版)
화중과기대학학보(의학판)
JOURNAL OF HUAZHONG UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(HEALTH SCIENCES)
2004年
3期
243-246,251
,共5页
高红%戴五星%黄海浪%陈智浩%梁靓%程继忠%皇甫永穆
高紅%戴五星%黃海浪%陳智浩%樑靚%程繼忠%皇甫永穆
고홍%대오성%황해랑%진지호%량정%정계충%황보영목
信号肽%人结核杆菌%热休克蛋白65%分泌型原核穿梭表达质粒%重组卡介苗
信號肽%人結覈桿菌%熱休剋蛋白65%分泌型原覈穿梭錶達質粒%重組卡介苗
신호태%인결핵간균%열휴극단백65%분비형원핵천사표체질립%중조잡개묘
目的构建人结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)重组卡介苗(BCG)疫苗.方法用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原85B(Ag85B)的信号肽DNA序列,从pCMV-MTHSP 65质粒中扩增出HSP65全长基因.利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG-2100的人结核杆菌HSP70启动子下游,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65.利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中,经热诱导后,用SDS-PAG电泳来观察其表达水平.利用Western blot来检验HSP65的生物学活性.结果酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白65 DNA片段与报道结果完全一致,重组体的连接方向正确,阅读框与预期完全一致.热诱导后,重组BCG表达的65 kD(1 kD=0.992 1 ku)蛋白占菌体总蛋白的35.67 %,占裂解物上清总蛋白的74.09 %,表明重组的HSP65基因能在BCG中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶状态存在.通过Western blot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合.结论成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65,重组的HSP65基因能在BCG中高效表达,表达的HSP65具有生物学活性,重组BCG疫苗构建成功.
目的構建人結覈桿菌熱休剋蛋白65(HSP65)重組卡介苗(BCG)疫苗.方法用PCR技術從BCG基因組中擴增齣抗原85B(Ag85B)的信號肽DNA序列,從pCMV-MTHSP 65質粒中擴增齣HSP65全長基因.利用DNA重組技術將以上兩箇片段插入質粒pBCG-2100的人結覈桿菌HSP70啟動子下遊,構建一箇分泌型的原覈穿梭錶達質粒pBCG-SP-HSP65.利用電穿孔的方法將該質粒轉入BCG中,經熱誘導後,用SDS-PAG電泳來觀察其錶達水平.利用Western blot來檢驗HSP65的生物學活性.結果酶切鑒定、PCR和測序分析結果錶明,所剋隆的信號肽DNA片段和熱休剋蛋白65 DNA片段與報道結果完全一緻,重組體的連接方嚮正確,閱讀框與預期完全一緻.熱誘導後,重組BCG錶達的65 kD(1 kD=0.992 1 ku)蛋白佔菌體總蛋白的35.67 %,佔裂解物上清總蛋白的74.09 %,錶明重組的HSP65基因能在BCG中高效錶達,錶達的蛋白大部分以可溶狀態存在.通過Western blot證實分泌的該蛋白能與結覈桿菌HSP65的抗體特異性結閤.結論成功構建分泌型原覈穿梭錶達質粒pBCG-SP-HSP65,重組的HSP65基因能在BCG中高效錶達,錶達的HSP65具有生物學活性,重組BCG疫苗構建成功.
목적구건인결핵간균열휴극단백65(HSP65)중조잡개묘(BCG)역묘.방법용PCR기술종BCG기인조중확증출항원85B(Ag85B)적신호태DNA서렬,종pCMV-MTHSP 65질립중확증출HSP65전장기인.이용DNA중조기술장이상량개편단삽입질립pBCG-2100적인결핵간균HSP70계동자하유,구건일개분비형적원핵천사표체질립pBCG-SP-HSP65.이용전천공적방법장해질립전입BCG중,경열유도후,용SDS-PAG전영래관찰기표체수평.이용Western blot래검험HSP65적생물학활성.결과매절감정、PCR화측서분석결과표명,소극륭적신호태DNA편단화열휴극단백65 DNA편단여보도결과완전일치,중조체적련접방향정학,열독광여예기완전일치.열유도후,중조BCG표체적65 kD(1 kD=0.992 1 ku)단백점균체총단백적35.67 %,점렬해물상청총단백적74.09 %,표명중조적HSP65기인능재BCG중고효표체,표체적단백대부분이가용상태존재.통과Western blot증실분비적해단백능여결핵간균HSP65적항체특이성결합.결론성공구건분비형원핵천사표체질립pBCG-SP-HSP65,중조적HSP65기인능재BCG중고효표체,표체적HSP65구유생물학활성,중조BCG역묘구건성공.
