中国实验诊断学
中國實驗診斷學
중국실험진단학
CHINESE JOURNAL OF LABORATORY DIAGNOSIS
2008年
1期
38-41
,共4页
张红梅%乐晓华%徐六妹%李丽雄%王火生%周伯平%陈玉丙
張紅梅%樂曉華%徐六妹%李麗雄%王火生%週伯平%陳玉丙
장홍매%악효화%서륙매%리려웅%왕화생%주백평%진옥병
基质金属蛋白酶组织抑制因子TIMP1%大鼠肝星状细胞株HSC-T6%肝纤维化%RNA干扰%慢病毒RNAi载体
基質金屬蛋白酶組織抑製因子TIMP1%大鼠肝星狀細胞株HSC-T6%肝纖維化%RNA榦擾%慢病毒RNAi載體
기질금속단백매조직억제인자TIMP1%대서간성상세포주HSC-T6%간섬유화%RNA간우%만병독RNAi재체
目的 构建大鼠TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体,并观察其转染HSC-T6细胞后对TIMP1基因表达的影响.方法 根据BLOCK-It Poll miR RNAi Expression System with EmGFP要求,应用在线miRNA设计工具http://rnaidesigner.invitrogen.com/maiexpress/,针对大鼠TINP1基因(GenBank:U06179)的598位点设计、合成Oligo DNA,退火形成双链DNA后,与载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR连接,转化Top10感受态细胞,构建TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体.经PCR扩增及测序鉴定正确后,以脂质体Lipofectimine.TM2000介导转染经TGF-β1刺激的大鼠肝星状细胞株HSC-T6,24、48、72h后收集细胞,应用RT-PCR鉴定TIMP1的表达情况.结果 经PCR及测序鉴定构建的TIMP1 miRNA慢病毒RNAj载体正确;将其转染经TGF-β1刺激的大鼠肝星状细胞株HSC-T6,48 h即可见TIMP1 Mrna表达量下降,72 h检测不到TIMP1 Mrna的表达,而未转染组及转染pLacZ-miR/GFP(阴性对照)组未见此改变.结论 成功构建大鼠TIMP1 miR-NA慢病毒RNAi载体Ptimp1-miR/GFP;Ptimp1-miR/GFP使大鼠肝星状细胞株HSC-T6 TIMP1基因沉默.提示了RNA干扰可使肝纤维化形成过程中的关键因子TIMP1基因沉默,为RNA干扰技术进一步应用治疗大鼠肝纤维化模型奠定了基础.
目的 構建大鼠TIMP1 miRNA慢病毒RNAi載體,併觀察其轉染HSC-T6細胞後對TIMP1基因錶達的影響.方法 根據BLOCK-It Poll miR RNAi Expression System with EmGFP要求,應用在線miRNA設計工具http://rnaidesigner.invitrogen.com/maiexpress/,針對大鼠TINP1基因(GenBank:U06179)的598位點設計、閤成Oligo DNA,退火形成雙鏈DNA後,與載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR連接,轉化Top10感受態細胞,構建TIMP1 miRNA慢病毒RNAi載體.經PCR擴增及測序鑒定正確後,以脂質體Lipofectimine.TM2000介導轉染經TGF-β1刺激的大鼠肝星狀細胞株HSC-T6,24、48、72h後收集細胞,應用RT-PCR鑒定TIMP1的錶達情況.結果 經PCR及測序鑒定構建的TIMP1 miRNA慢病毒RNAj載體正確;將其轉染經TGF-β1刺激的大鼠肝星狀細胞株HSC-T6,48 h即可見TIMP1 Mrna錶達量下降,72 h檢測不到TIMP1 Mrna的錶達,而未轉染組及轉染pLacZ-miR/GFP(陰性對照)組未見此改變.結論 成功構建大鼠TIMP1 miR-NA慢病毒RNAi載體Ptimp1-miR/GFP;Ptimp1-miR/GFP使大鼠肝星狀細胞株HSC-T6 TIMP1基因沉默.提示瞭RNA榦擾可使肝纖維化形成過程中的關鍵因子TIMP1基因沉默,為RNA榦擾技術進一步應用治療大鼠肝纖維化模型奠定瞭基礎.
목적 구건대서TIMP1 miRNA만병독RNAi재체,병관찰기전염HSC-T6세포후대TIMP1기인표체적영향.방법 근거BLOCK-It Poll miR RNAi Expression System with EmGFP요구,응용재선miRNA설계공구http://rnaidesigner.invitrogen.com/maiexpress/,침대대서TINP1기인(GenBank:U06179)적598위점설계、합성Oligo DNA,퇴화형성쌍련DNA후,여재체pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR련접,전화Top10감수태세포,구건TIMP1 miRNA만병독RNAi재체.경PCR확증급측서감정정학후,이지질체Lipofectimine.TM2000개도전염경TGF-β1자격적대서간성상세포주HSC-T6,24、48、72h후수집세포,응용RT-PCR감정TIMP1적표체정황.결과 경PCR급측서감정구건적TIMP1 miRNA만병독RNAj재체정학;장기전염경TGF-β1자격적대서간성상세포주HSC-T6,48 h즉가견TIMP1 Mrna표체량하강,72 h검측불도TIMP1 Mrna적표체,이미전염조급전염pLacZ-miR/GFP(음성대조)조미견차개변.결론 성공구건대서TIMP1 miR-NA만병독RNAi재체Ptimp1-miR/GFP;Ptimp1-miR/GFP사대서간성상세포주HSC-T6 TIMP1기인침묵.제시료RNA간우가사간섬유화형성과정중적관건인자TIMP1기인침묵,위RNA간우기술진일보응용치료대서간섬유화모형전정료기출.
