生物化学与生物物理进展
生物化學與生物物理進展
생물화학여생물물리진전
PROGRESS IN BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS
2001年
5期
704-710
,共7页
赵晓荣%王承兴%罗非君%顾焕华%唐敏%夏林庆%邓琳%易薇%邓锡云%曹亚
趙曉榮%王承興%囉非君%顧煥華%唐敏%夏林慶%鄧琳%易薇%鄧錫雲%曹亞
조효영%왕승흥%라비군%고환화%당민%하림경%산림%역미%산석운%조아
EB病毒%潜伏膜蛋白1%周期蛋白D1
EB病毒%潛伏膜蛋白1%週期蛋白D1
EB병독%잠복막단백1%주기단백D1
为了探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(EBV-LMP1)促进细胞增殖,参与EBV相关疾病致瘤的分子机制,研究了LMP1在鼻咽癌细胞中调节cyclinD1表达,进而影响细胞周期行进及细胞恶性表型改变,并初步确定了LMP1发挥该功能的结构域.利用已建株的Tet-on-LMP1-HNE2鼻咽癌细胞系,蛋白质印迹实验分析LMP1诱导cyclinD1蛋白质表达的表达动力学,包括时间效应及剂量效应;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照,确定LMP1活化cyclinD1表达的结构域.同时结合基因诱导表达及反义寡聚核酸技术阻断基因表达的实验方法,进一步确定LMP1上调的cyclinD1功能,即对细胞周期行进及细胞恶性表型的影响.结果表明LMP1确实可以诱导cyclinD1的表达(2～4倍),且诱导具有时间依赖性及剂量依赖性;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照,结合报道基因分析法,确定与空白载体细胞系比较,野生型LMP1从转录水平可反式激活cyclinD1报道基因活性约11.2倍,其中CTAR1及CTAR2均可活化cyclinD1表达,但以CTAR2为主,与野生型LMP1诱导cyclinD1反式激活活性比较,CTAR1缺失导致cyclinD1报道基因活性下降23.6%,CTAR2缺失导致cyclinD1活性下降约80.7%,C端均缺失时cyclinD1活性只有野生型的17.7%.流式细胞仪分析显示,强力霉素诱导后cyclinD1高表达的细胞停留于G0/G1期明显减少,较未经诱导的细胞,从66.42%减至56.55%,而进入S期及G2/M期的细胞明显增多.在稳定表达LMP1的细胞中,与导入正义LMP1比较,导入反义LMP1 PS-ODNs及反义cylinD1,可以使细胞软琼脂集落形成率明显降低(从30.48%分别降至15.21%,21.76%).EBV-LMP1可以活化cyclinD1的表达,且发挥这种功能的结构域以CTAR2为主,活化的cyclinD1参与细胞周期行进,抑制LMP1及cyclinD1的表达均可导致细胞软琼脂集落形成率降低.
為瞭探討EB病毒編碼的潛伏膜蛋白1(EBV-LMP1)促進細胞增殖,參與EBV相關疾病緻瘤的分子機製,研究瞭LMP1在鼻嚥癌細胞中調節cyclinD1錶達,進而影響細胞週期行進及細胞噁性錶型改變,併初步確定瞭LMP1髮揮該功能的結構域.利用已建株的Tet-on-LMP1-HNE2鼻嚥癌細胞繫,蛋白質印跡實驗分析LMP1誘導cyclinD1蛋白質錶達的錶達動力學,包括時間效應及劑量效應;利用三種LMP1功能區缺失的突變體及野生型LMP1,以載體型細胞為對照,確定LMP1活化cyclinD1錶達的結構域.同時結閤基因誘導錶達及反義寡聚覈痠技術阻斷基因錶達的實驗方法,進一步確定LMP1上調的cyclinD1功能,即對細胞週期行進及細胞噁性錶型的影響.結果錶明LMP1確實可以誘導cyclinD1的錶達(2～4倍),且誘導具有時間依賴性及劑量依賴性;利用三種LMP1功能區缺失的突變體及野生型LMP1,以載體型細胞為對照,結閤報道基因分析法,確定與空白載體細胞繫比較,野生型LMP1從轉錄水平可反式激活cyclinD1報道基因活性約11.2倍,其中CTAR1及CTAR2均可活化cyclinD1錶達,但以CTAR2為主,與野生型LMP1誘導cyclinD1反式激活活性比較,CTAR1缺失導緻cyclinD1報道基因活性下降23.6%,CTAR2缺失導緻cyclinD1活性下降約80.7%,C耑均缺失時cyclinD1活性隻有野生型的17.7%.流式細胞儀分析顯示,彊力黴素誘導後cyclinD1高錶達的細胞停留于G0/G1期明顯減少,較未經誘導的細胞,從66.42%減至56.55%,而進入S期及G2/M期的細胞明顯增多.在穩定錶達LMP1的細胞中,與導入正義LMP1比較,導入反義LMP1 PS-ODNs及反義cylinD1,可以使細胞軟瓊脂集落形成率明顯降低(從30.48%分彆降至15.21%,21.76%).EBV-LMP1可以活化cyclinD1的錶達,且髮揮這種功能的結構域以CTAR2為主,活化的cyclinD1參與細胞週期行進,抑製LMP1及cyclinD1的錶達均可導緻細胞軟瓊脂集落形成率降低.
위료탐토EB병독편마적잠복막단백1(EBV-LMP1)촉진세포증식,삼여EBV상관질병치류적분자궤제,연구료LMP1재비인암세포중조절cyclinD1표체,진이영향세포주기행진급세포악성표형개변,병초보학정료LMP1발휘해공능적결구역.이용이건주적Tet-on-LMP1-HNE2비인암세포계,단백질인적실험분석LMP1유도cyclinD1단백질표체적표체동역학,포괄시간효응급제량효응;이용삼충LMP1공능구결실적돌변체급야생형LMP1,이재체형세포위대조,학정LMP1활화cyclinD1표체적결구역.동시결합기인유도표체급반의과취핵산기술조단기인표체적실험방법,진일보학정LMP1상조적cyclinD1공능,즉대세포주기행진급세포악성표형적영향.결과표명LMP1학실가이유도cyclinD1적표체(2～4배),차유도구유시간의뢰성급제량의뢰성;이용삼충LMP1공능구결실적돌변체급야생형LMP1,이재체형세포위대조,결합보도기인분석법,학정여공백재체세포계비교,야생형LMP1종전록수평가반식격활cyclinD1보도기인활성약11.2배,기중CTAR1급CTAR2균가활화cyclinD1표체,단이CTAR2위주,여야생형LMP1유도cyclinD1반식격활활성비교,CTAR1결실도치cyclinD1보도기인활성하강23.6%,CTAR2결실도치cyclinD1활성하강약80.7%,C단균결실시cyclinD1활성지유야생형적17.7%.류식세포의분석현시,강력매소유도후cyclinD1고표체적세포정류우G0/G1기명현감소,교미경유도적세포,종66.42%감지56.55%,이진입S기급G2/M기적세포명현증다.재은정표체LMP1적세포중,여도입정의LMP1비교,도입반의LMP1 PS-ODNs급반의cylinD1,가이사세포연경지집락형성솔명현강저(종30.48%분별강지15.21%,21.76%).EBV-LMP1가이활화cyclinD1적표체,차발휘저충공능적결구역이CTAR2위주,활화적cyclinD1삼여세포주기행진,억제LMP1급cyclinD1적표체균가도치세포연경지집락형성솔강저.
