细胞与分子免疫学杂志
細胞與分子免疫學雜誌
세포여분자면역학잡지
2007年
6期
515-519
,共5页
张义浜%施立楠%唱韶红%巩新%熊凌霜%吴军
張義浜%施立楠%唱韶紅%鞏新%熊凌霜%吳軍
장의빈%시립남%창소홍%공신%웅릉상%오군
人可溶性肿瘤坏死因子受体II%Fc融合蛋白%巴斯德毕赤酵母菌%荧光辅助糖电泳
人可溶性腫瘤壞死因子受體II%Fc融閤蛋白%巴斯德畢赤酵母菌%熒光輔助糖電泳
인가용성종류배사인자수체II%Fc융합단백%파사덕필적효모균%형광보조당전영
目的: 在毕赤酵母菌中表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白.检测融合蛋白是否形成二聚体,并对其N-糖链进行分析.方法: 从人淋巴细胞中提取总RNA, 经RT-PCR扩增目的基因sTNFRII与IgG Fc, 然后利用重叠延伸PCR得到嵌合体基因sTNFRII-IgG Fc, 并将其插入pPIC9载体中.以重组载体转化巴斯德毕赤酵母菌中进行克隆与表达.采用ELISA筛选高表达sTNFRII-IgG Fc融合蛋白的重组毕赤酵母菌株, 对融合蛋白通过还原和非还原SDS-PAGE分析其二聚体结构, 采用L929细胞检测融合蛋白抗TNF-α的生物学活性, 最后利用荧光辅助糖电泳(FACE)分析融合蛋白的N-糖链.结果: 成功地建立了可分泌表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白的重组酵母菌株, 摇瓶培养后融合蛋白的表达量为2 mg/L.SDS-PAGE和Western blot表明, 该融合蛋白能自然形成二聚体结构; 可抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用, 其中和5×104 U/L TNF-α的EC50为170 μg/L.FACE分析融合蛋白N-糖链的大小为11 ～13个糖残基.结论: 在毕赤酵母菌中成功地表达了sTNFR II-IgG Fc融合蛋白, 为在毕赤酵母菌中表达其他的Fc融合蛋白和抗体提供了参考.
目的: 在畢赤酵母菌中錶達sTNFR II-IgG Fc融閤蛋白.檢測融閤蛋白是否形成二聚體,併對其N-糖鏈進行分析.方法: 從人淋巴細胞中提取總RNA, 經RT-PCR擴增目的基因sTNFRII與IgG Fc, 然後利用重疊延伸PCR得到嵌閤體基因sTNFRII-IgG Fc, 併將其插入pPIC9載體中.以重組載體轉化巴斯德畢赤酵母菌中進行剋隆與錶達.採用ELISA篩選高錶達sTNFRII-IgG Fc融閤蛋白的重組畢赤酵母菌株, 對融閤蛋白通過還原和非還原SDS-PAGE分析其二聚體結構, 採用L929細胞檢測融閤蛋白抗TNF-α的生物學活性, 最後利用熒光輔助糖電泳(FACE)分析融閤蛋白的N-糖鏈.結果: 成功地建立瞭可分泌錶達sTNFR II-IgG Fc融閤蛋白的重組酵母菌株, 搖瓶培養後融閤蛋白的錶達量為2 mg/L.SDS-PAGE和Western blot錶明, 該融閤蛋白能自然形成二聚體結構; 可抑製TNF-α對L929細胞的殺傷作用, 其中和5×104 U/L TNF-α的EC50為170 μg/L.FACE分析融閤蛋白N-糖鏈的大小為11 ～13箇糖殘基.結論: 在畢赤酵母菌中成功地錶達瞭sTNFR II-IgG Fc融閤蛋白, 為在畢赤酵母菌中錶達其他的Fc融閤蛋白和抗體提供瞭參攷.
목적: 재필적효모균중표체sTNFR II-IgG Fc융합단백.검측융합단백시부형성이취체,병대기N-당련진행분석.방법: 종인림파세포중제취총RNA, 경RT-PCR확증목적기인sTNFRII여IgG Fc, 연후이용중첩연신PCR득도감합체기인sTNFRII-IgG Fc, 병장기삽입pPIC9재체중.이중조재체전화파사덕필적효모균중진행극륭여표체.채용ELISA사선고표체sTNFRII-IgG Fc융합단백적중조필적효모균주, 대융합단백통과환원화비환원SDS-PAGE분석기이취체결구, 채용L929세포검측융합단백항TNF-α적생물학활성, 최후이용형광보조당전영(FACE)분석융합단백적N-당련.결과: 성공지건립료가분비표체sTNFR II-IgG Fc융합단백적중조효모균주, 요병배양후융합단백적표체량위2 mg/L.SDS-PAGE화Western blot표명, 해융합단백능자연형성이취체결구; 가억제TNF-α대L929세포적살상작용, 기중화5×104 U/L TNF-α적EC50위170 μg/L.FACE분석융합단백N-당련적대소위11 ～13개당잔기.결론: 재필적효모균중성공지표체료sTNFR II-IgG Fc융합단백, 위재필적효모균중표체기타적Fc융합단백화항체제공료삼고.
