中国畜牧兽医
中國畜牧獸醫
중국축목수의
CHINA ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE
2010年
5期
60-65
,共6页
刘根梅%谭实勇%陈瑞爱%黄红亮%郑念广%罗满林
劉根梅%譚實勇%陳瑞愛%黃紅亮%鄭唸廣%囉滿林
류근매%담실용%진서애%황홍량%정념엄%라만림
猪圆环病毒2型%ORF2%重组腺病毒
豬圓環病毒2型%ORF2%重組腺病毒
저원배병독2형%ORF2%중조선병독
为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,本试验根据GenBank中猪圆环病毒2型基因序列,设计了1对引物,用于猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增.将目的基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ORF2.经PCR方法和限制性内切酶酶切法及测序证明该基因已成功连接后,重组腺病毒转移载体经PmeⅠ酶切线性化,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-CMV-ORF2.经PCR方法和PacⅠ酶切方法及测序鉴定表明该重组腺病毒载体已构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化pAd-CMV-ORF2,脂质体法转染AD293细胞进行病毒的包装和扩增.PCR及RT-PCR、IFA、Western blotting检测目的基因及其表达.结果表明,本试验成功构建了重组腺病毒pAd-CMV-ORF2.3次噬斑试验纯化重组腺病毒.测得其TCID50为10-8.75/0.1 mL.将重组腺病毒接种SPF级雌性BALB/c小鼠,用ELISA抗体检测试剂盒检测特异性抗体水平.小鼠免疫试验测得其特异性抗体水平较高,为PCV2重组腺病毒基因工程疫苗的进一步研究打下基础.
為瞭研究含有豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重組腺病毒作為基因工程疫苗的潛在應用價值,本試驗根據GenBank中豬圓環病毒2型基因序列,設計瞭1對引物,用于豬圓環病毒2型ORF2基因的擴增.將目的基因T/A剋隆後,亞剋隆至腺病毒轉移載體pShuttle-CMV,構建重組穿梭質粒pShuttle-CMV-ORF2.經PCR方法和限製性內切酶酶切法及測序證明該基因已成功連接後,重組腺病毒轉移載體經PmeⅠ酶切線性化,在BJ5183細菌中與腺病毒骨架載體pAdEasy-1同源重組穫得重組腺病毒質粒pAd-CMV-ORF2.經PCR方法和PacⅠ酶切方法及測序鑒定錶明該重組腺病毒載體已構建成功.Pac Ⅰ酶切線性化pAd-CMV-ORF2,脂質體法轉染AD293細胞進行病毒的包裝和擴增.PCR及RT-PCR、IFA、Western blotting檢測目的基因及其錶達.結果錶明,本試驗成功構建瞭重組腺病毒pAd-CMV-ORF2.3次噬斑試驗純化重組腺病毒.測得其TCID50為10-8.75/0.1 mL.將重組腺病毒接種SPF級雌性BALB/c小鼠,用ELISA抗體檢測試劑盒檢測特異性抗體水平.小鼠免疫試驗測得其特異性抗體水平較高,為PCV2重組腺病毒基因工程疫苗的進一步研究打下基礎.
위료연구함유저원배병독2형(porcine circovirus type 2,PCV2)적중조선병독작위기인공정역묘적잠재응용개치,본시험근거GenBank중저원배병독2형기인서렬,설계료1대인물,용우저원배병독2형ORF2기인적확증.장목적기인T/A극륭후,아극륭지선병독전이재체pShuttle-CMV,구건중조천사질립pShuttle-CMV-ORF2.경PCR방법화한제성내절매매절법급측서증명해기인이성공련접후,중조선병독전이재체경PmeⅠ매절선성화,재BJ5183세균중여선병독골가재체pAdEasy-1동원중조획득중조선병독질립pAd-CMV-ORF2.경PCR방법화PacⅠ매절방법급측서감정표명해중조선병독재체이구건성공.Pac Ⅰ매절선성화pAd-CMV-ORF2,지질체법전염AD293세포진행병독적포장화확증.PCR급RT-PCR、IFA、Western blotting검측목적기인급기표체.결과표명,본시험성공구건료중조선병독pAd-CMV-ORF2.3차서반시험순화중조선병독.측득기TCID50위10-8.75/0.1 mL.장중조선병독접충SPF급자성BALB/c소서,용ELISA항체검측시제합검측특이성항체수평.소서면역시험측득기특이성항체수평교고,위PCV2중조선병독기인공정역묘적진일보연구타하기출.
