中华临床免疫和变态反应杂志
中華臨床免疫和變態反應雜誌
중화림상면역화변태반응잡지
CHINESE JOURNAL OF ALLERGY & CLINICAL IMMUNOLOGY
2009年
4期
259-262
,共4页
李雅林%白波%陈京%刘有旺%杜辉%刘海青%于鹏丽
李雅林%白波%陳京%劉有旺%杜輝%劉海青%于鵬麗
리아림%백파%진경%류유왕%두휘%류해청%우붕려
apelin受体%真核表达载体%HEK293细胞
apelin受體%真覈錶達載體%HEK293細胞
apelin수체%진핵표체재체%HEK293세포
目的 构建与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGEP)融合的人apelin受体(Apelin receptor,apelin-R)真核表达载体.方法 以质粒pcDNA3.1-hApelin-R为模板,PCR方法扩增人apelin受体.扩增的人apelin受体用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,同时用这两种酶双酶切质粒peGFP-C1.然后将两种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10.挑取菌落培养,提取质粒,然后进行酶切鉴定,最后进行测序.将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾(human embryonic kidney 293,HEK293)细胞,共聚焦显微镜观察.提取转染细胞的总蛋白,进行Western blot检测.结果 扩增出一条约1 200bp的片段,与预期的apelin受体大小相符.酶切结果显示,重组质粒pEGFP-hApelin-R被切成两条片段,其中一条为peGFP-C1载体大小,另一条为目的 片段大小.经测序鉴定,序列与GenBank(NM_005161)中的序列高度同源.共聚焦显微镜观察显示,人apelin受体主要在细胞膜上表达.Western blot结果显示在相对分子质量69 000处有一蛋白条带,与预期大小相符.结论 构建成功pEGFP-hApelin-R重组表达载体,此表达载体可用于检测apelin受体和κ型阿片受体(kappa opioid receptor,KOR)或与其他受体间的相互作用.
目的 構建與增彊型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGEP)融閤的人apelin受體(Apelin receptor,apelin-R)真覈錶達載體.方法 以質粒pcDNA3.1-hApelin-R為模闆,PCR方法擴增人apelin受體.擴增的人apelin受體用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切,同時用這兩種酶雙酶切質粒peGFP-C1.然後將兩種酶切產物按常規方法連接、轉化大腸桿菌Top10.挑取菌落培養,提取質粒,然後進行酶切鑒定,最後進行測序.將測序正確的重組載體用脂質體法轉染人胚胎腎(human embryonic kidney 293,HEK293)細胞,共聚焦顯微鏡觀察.提取轉染細胞的總蛋白,進行Western blot檢測.結果 擴增齣一條約1 200bp的片段,與預期的apelin受體大小相符.酶切結果顯示,重組質粒pEGFP-hApelin-R被切成兩條片段,其中一條為peGFP-C1載體大小,另一條為目的 片段大小.經測序鑒定,序列與GenBank(NM_005161)中的序列高度同源.共聚焦顯微鏡觀察顯示,人apelin受體主要在細胞膜上錶達.Western blot結果顯示在相對分子質量69 000處有一蛋白條帶,與預期大小相符.結論 構建成功pEGFP-hApelin-R重組錶達載體,此錶達載體可用于檢測apelin受體和κ型阿片受體(kappa opioid receptor,KOR)或與其他受體間的相互作用.
목적 구건여증강형록색형광단백(enhanced green fluorescent protein,EGEP)융합적인apelin수체(Apelin receptor,apelin-R)진핵표체재체.방법 이질립pcDNA3.1-hApelin-R위모판,PCR방법확증인apelin수체.확증적인apelin수체용EcoR Ⅰ화BamH Ⅰ쌍매절,동시용저량충매쌍매절질립peGFP-C1.연후장량충매절산물안상규방법련접、전화대장간균Top10.도취균락배양,제취질립,연후진행매절감정,최후진행측서.장측서정학적중조재체용지질체법전염인배태신(human embryonic kidney 293,HEK293)세포,공취초현미경관찰.제취전염세포적총단백,진행Western blot검측.결과 확증출일조약1 200bp적편단,여예기적apelin수체대소상부.매절결과현시,중조질립pEGFP-hApelin-R피절성량조편단,기중일조위peGFP-C1재체대소,령일조위목적 편단대소.경측서감정,서렬여GenBank(NM_005161)중적서렬고도동원.공취초현미경관찰현시,인apelin수체주요재세포막상표체.Western blot결과현시재상대분자질량69 000처유일단백조대,여예기대소상부.결론 구건성공pEGFP-hApelin-R중조표체재체,차표체재체가용우검측apelin수체화κ형아편수체(kappa opioid receptor,KOR)혹여기타수체간적상호작용.
