西安交通大学学报（医学版）
西安交通大學學報（醫學版）
서안교통대학학보（의학판）
JOURNAL OF XI'AN JIAOTONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)
2008年
5期
499-503
,共5页
李奇灵%王英%王运萍%冯彩霞%高尚风
李奇靈%王英%王運萍%馮綵霞%高尚風
리기령%왕영%왕운평%풍채하%고상풍
NuTu-19细胞%粒细胞单核细胞集落刺激因子%卵巢肿瘤%免疫治疗
NuTu-19細胞%粒細胞單覈細胞集落刺激因子%卵巢腫瘤%免疫治療
NuTu-19세포%립세포단핵세포집락자격인자%란소종류%면역치료
目的 构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF.方法 将T-h GM-CSF重组质粒转化入感受态大肠杆菌中,筛选出耐药性单克隆菌落送测序.利用PCR技术扩增出GM-CSF目的 基因片段,将PCR产物连入pGEM-T easy载体,转化入大肠杆菌中扩增,用SDS碱裂解法提取Teasy-GM-CSF重组质粒,用限制性内切酶酶切Teasy-GM-CSF重组载体,连入经相同酶酶切的pLXSN反转录病毒载体中.用磷酸钙沉淀法转染PA317包装细胞系进行病毒包装,用含有病毒的上清液感染卵巢癌NuTu-19细胞,经G418加压筛选感染成功的NuTu-19/GM-CSF细胞,用免疫细胞化学和ELISA法检测NuTu-19/GM-CSF分泌表达GM-CSF蛋白的情况.结果 T-h GM-CSF重组质粒测序结果与GenBank Accession#:NM_000758基因序列对比后确定为人类GM-CSF基因编码序列;PCR产物酶切电泳在Mark 400-500bp中有一条带,符合GM-CSF基因序列长度;重组Teasy-GM-CSF质粒用EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶酶切后,电泳鉴定在400-500bp之间有一目的 条带,重组反转录病毒质粒pLGM-CSFSN酶切电泳有目的 条带;G418加压筛选感染后的NuTu-19细胞,14d后慢慢形成单克隆继续生长;免疫细胞化学检测到感染成功的NuTu-19细胞膜表面有明显的棕褐色颗粒沉淀,ELISA法检测细胞培养上清液中GM-CSF的质量浓度为150pg/mL.结论 成功构建了能分泌表达人GM-CSF蛋白的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF,为以后研究卵巢癌免疫治疗提供必备、有效、可靠的工具基础.
目的 構建能分泌錶達粒細胞-單覈細胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌細胞NuTu-19/GM-CSF.方法 將T-h GM-CSF重組質粒轉化入感受態大腸桿菌中,篩選齣耐藥性單剋隆菌落送測序.利用PCR技術擴增齣GM-CSF目的 基因片段,將PCR產物連入pGEM-T easy載體,轉化入大腸桿菌中擴增,用SDS堿裂解法提取Teasy-GM-CSF重組質粒,用限製性內切酶酶切Teasy-GM-CSF重組載體,連入經相同酶酶切的pLXSN反轉錄病毒載體中.用燐痠鈣沉澱法轉染PA317包裝細胞繫進行病毒包裝,用含有病毒的上清液感染卵巢癌NuTu-19細胞,經G418加壓篩選感染成功的NuTu-19/GM-CSF細胞,用免疫細胞化學和ELISA法檢測NuTu-19/GM-CSF分泌錶達GM-CSF蛋白的情況.結果 T-h GM-CSF重組質粒測序結果與GenBank Accession#:NM_000758基因序列對比後確定為人類GM-CSF基因編碼序列;PCR產物酶切電泳在Mark 400-500bp中有一條帶,符閤GM-CSF基因序列長度;重組Teasy-GM-CSF質粒用EcoRⅠ、BamHⅠ限製性內切酶酶切後,電泳鑒定在400-500bp之間有一目的 條帶,重組反轉錄病毒質粒pLGM-CSFSN酶切電泳有目的 條帶;G418加壓篩選感染後的NuTu-19細胞,14d後慢慢形成單剋隆繼續生長;免疫細胞化學檢測到感染成功的NuTu-19細胞膜錶麵有明顯的棕褐色顆粒沉澱,ELISA法檢測細胞培養上清液中GM-CSF的質量濃度為150pg/mL.結論 成功構建瞭能分泌錶達人GM-CSF蛋白的卵巢癌細胞NuTu-19/GM-CSF,為以後研究卵巢癌免疫治療提供必備、有效、可靠的工具基礎.
목적 구건능분비표체립세포-단핵세포집락자격인자(GM-CSF)적란소암세포NuTu-19/GM-CSF.방법 장T-h GM-CSF중조질립전화입감수태대장간균중,사선출내약성단극륭균락송측서.이용PCR기술확증출GM-CSF목적 기인편단,장PCR산물련입pGEM-T easy재체,전화입대장간균중확증,용SDS감렬해법제취Teasy-GM-CSF중조질립,용한제성내절매매절Teasy-GM-CSF중조재체,련입경상동매매절적pLXSN반전록병독재체중.용린산개침정법전염PA317포장세포계진행병독포장,용함유병독적상청액감염란소암NuTu-19세포,경G418가압사선감염성공적NuTu-19/GM-CSF세포,용면역세포화학화ELISA법검측NuTu-19/GM-CSF분비표체GM-CSF단백적정황.결과 T-h GM-CSF중조질립측서결과여GenBank Accession#:NM_000758기인서렬대비후학정위인류GM-CSF기인편마서렬;PCR산물매절전영재Mark 400-500bp중유일조대,부합GM-CSF기인서렬장도;중조Teasy-GM-CSF질립용EcoRⅠ、BamHⅠ한제성내절매매절후,전영감정재400-500bp지간유일목적 조대,중조반전록병독질립pLGM-CSFSN매절전영유목적 조대;G418가압사선감염후적NuTu-19세포,14d후만만형성단극륭계속생장;면역세포화학검측도감염성공적NuTu-19세포막표면유명현적종갈색과립침정,ELISA법검측세포배양상청액중GM-CSF적질량농도위150pg/mL.결론 성공구건료능분비표체인GM-CSF단백적란소암세포NuTu-19/GM-CSF,위이후연구란소암면역치료제공필비、유효、가고적공구기출.
