科技导报
科技導報
과기도보
SCIENCE & TECHNOLOGY REVIEW
2006年
3期
14-17
,共4页
王泽霖%李建丽%陈少渠%刘守川
王澤霖%李建麗%陳少渠%劉守川
왕택림%리건려%진소거%류수천
AIV,H5N2亚型%RT-PCR%NS1基因%表达%间接ELISA
AIV,H5N2亞型%RT-PCR%NS1基因%錶達%間接ELISA
AIV,H5N2아형%RT-PCR%NS1기인%표체%간접ELISA
利用RT-PCR技术扩增获得了H5N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为678 bp.成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21(DE3),用终浓度1 mmol/I的IPTG诱导表达5 h,经15%的SDS-PAGE分析表明,诱导表达出了分子量大约为28 KD的NS1融合蛋白,且以包涵体的形式存在.NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化或用尿素变性复性,获得纯度较高的NS1蛋白,并以此为抗原,建立了检测抗NS1蛋白抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法.最佳包被浓度为2.5 μ g/ml,血清的最佳稀释倍数为1:200,酶标二抗的最佳工作稀释度为1:5000.重组NS1蛋白只与AIV感染的血清反应,而不与ND、IB、IBD、EDS76的阳性血清反应.分别检测H9N2、H5N2和H5N1亚型灭活疫苗和H9N2纯化病毒免疫的血清,各5份,其平均OD490值分别为0.225、0.210、0.205和0.184,均为阴性;而对HgN2和H5N2亚型活毒感染10～15 d的血清进行检测,各5份,其平均OD490值分别为0.610和0.619,均为阳性.因此,NS1蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群,可作为一种鉴别诊断标记,但不能区分亚型,具有A型特异性.NS1-ELISA方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法.
利用RT-PCR技術擴增穫得瞭H5N2亞型禽流感病毒的NS1基因,ORF長度為678 bp.成功構建瞭重組錶達載體pET-NS1,將其轉化BL21(DE3),用終濃度1 mmol/I的IPTG誘導錶達5 h,經15%的SDS-PAGE分析錶明,誘導錶達齣瞭分子量大約為28 KD的NS1融閤蛋白,且以包涵體的形式存在.NS1融閤蛋白經His trap Hp Kit柱子純化或用尿素變性複性,穫得純度較高的NS1蛋白,併以此為抗原,建立瞭檢測抗NS1蛋白抗體的ELISA(NS1-ELISA)方法.最佳包被濃度為2.5 μ g/ml,血清的最佳稀釋倍數為1:200,酶標二抗的最佳工作稀釋度為1:5000.重組NS1蛋白隻與AIV感染的血清反應,而不與ND、IB、IBD、EDS76的暘性血清反應.分彆檢測H9N2、H5N2和H5N1亞型滅活疫苗和H9N2純化病毒免疫的血清,各5份,其平均OD490值分彆為0.225、0.210、0.205和0.184,均為陰性;而對HgN2和H5N2亞型活毒感染10～15 d的血清進行檢測,各5份,其平均OD490值分彆為0.610和0.619,均為暘性.因此,NS1蛋白能特異地區分野毒感染和滅活疫苗免疫鷄群,可作為一種鑒彆診斷標記,但不能區分亞型,具有A型特異性.NS1-ELISA方法的初步應用,不僅為生產提供瞭一種快速、特異、敏感的鑒彆診斷方法,為進一步組裝成試劑盒奠定瞭基礎,也為禽流感的早期診斷、適時鑑控和淨化提供瞭行之有效的方法.
이용RT-PCR기술확증획득료H5N2아형금류감병독적NS1기인,ORF장도위678 bp.성공구건료중조표체재체pET-NS1,장기전화BL21(DE3),용종농도1 mmol/I적IPTG유도표체5 h,경15%적SDS-PAGE분석표명,유도표체출료분자량대약위28 KD적NS1융합단백,차이포함체적형식존재.NS1융합단백경His trap Hp Kit주자순화혹용뇨소변성복성,획득순도교고적NS1단백,병이차위항원,건립료검측항NS1단백항체적ELISA(NS1-ELISA)방법.최가포피농도위2.5 μ g/ml,혈청적최가희석배수위1:200,매표이항적최가공작희석도위1:5000.중조NS1단백지여AIV감염적혈청반응,이불여ND、IB、IBD、EDS76적양성혈청반응.분별검측H9N2、H5N2화H5N1아형멸활역묘화H9N2순화병독면역적혈청,각5빈,기평균OD490치분별위0.225、0.210、0.205화0.184,균위음성;이대HgN2화H5N2아형활독감염10～15 d적혈청진행검측,각5빈,기평균OD490치분별위0.610화0.619,균위양성.인차,NS1단백능특이지구분야독감염화멸활역묘면역계군,가작위일충감별진단표기,단불능구분아형,구유A형특이성.NS1-ELISA방법적초보응용,불부위생산제공료일충쾌속、특이、민감적감별진단방법,위진일보조장성시제합전정료기출,야위금류감적조기진단、괄시감공화정화제공료행지유효적방법.
