CAJ | 학술논문

目的:用原核蛋白表达系统对兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)进行功能性表达,并对其活性进行鉴定.方法:从兔肝中克隆出NRDR全长序列,运用Gateway表达系统将其编码区序列构建到表达载体(pDEST 17)上,再转化到大肠杆菌(E.coli)(BL21-AI)中表达出兔NRDR蛋白并鉴定其表达形式;取工程菌裂解上清通过金属离子亲和层析纯化出目的蛋白,再运用反相高效液相色谱法(HPLC)测定该酶的Km值和Vmax值.结果:构建出含兔NRDR编码区(768 bp)的表达克隆,转化到BL21-AI中表达出氨基端含6×His标签的重组兔NRDR蛋白,诱导表达4 h后目的蛋白可占总蛋白量的41.4%;经一步亲和层析得到的兔NRDR纯度为97.2%,比活性提高了64倍;经HPLC测定,该酶对视黄醛的Km值为(4.55±0.33)μmol/L,Vmax为(0.307±0.065)μmol/(min·mg).结论:应用pDEST 17可在BL21-AI中对兔肝NRDR进行高效的功能性表达.
목적:용원핵단백표체계통대토보매Ⅱ의뢰성시황순탈경/환원매(NRDR)진행공능성표체,병대기활성진행감정.방법:종토간중극륭출NRDR전장서렬,운용Gateway표체계통장기편마구서렬구건도표체재체(pDEST 17)상,재전화도대장간균(E.coli)(BL21-AI)중표체출토NRDR단백병감정기표체형식;취공정균렬해상청통과금속리자친화층석순화출목적단백,재운용반상고효액상색보법(HPLC)측정해매적Km치화Vmax치.결과:구건출함토NRDR편마구(768 bp)적표체극륭,전화도BL21-AI중표체출안기단함6×His표첨적중조토NRDR단백,유도표체4 h후목적단백가점총단백량적41.4%;경일보친화층석득도적토NRDR순도위97.2%,비활성제고료64배;경HPLC측정,해매대시황철적Km치위(4.55±0.33)μmol/L,Vmax위(0.307±0.065)μmol/(min·mg).결론:응용pDEST 17가재BL21-AI중대토간NRDR진행고효적공능성표체.