中国免疫学杂志
中國免疫學雜誌
중국면역학잡지
CHINESE JOURNAL OF IMMUNOLOGY
2010年
8期
684-688
,共5页
郝建权%任桂萍%刘生伟%傅俊华%谷学佳%姚文兵%李宁%李德山
郝建權%任桂萍%劉生偉%傅俊華%穀學佳%姚文兵%李寧%李德山
학건권%임계평%류생위%부준화%곡학가%요문병%리저%리덕산
mIL-1β%SUMO%融合蛋白%原核表达%MTT%活性检测
mIL-1β%SUMO%融閤蛋白%原覈錶達%MTT%活性檢測
mIL-1β%SUMO%융합단백%원핵표체%MTT%활성검측
目的:从LPS刺激过的小鼠胸腺细胞中克隆IL-1β基因,通过原核表达,获得具有生物活性的可溶性鼠源IL-1β蛋白,为深入研究和利用IL-1β基因奠定基础.方法:提取LPS刺激的小鼠胸腺细胞总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-1β序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-1β的编码序列基因,并插入到原核表达载体pHisSUMO express中SUMO标签的下游,构建重组表达载体pHisSUMO express-mIL-1β.将该载体转化大肠杆菌Rosetta (DE3),IPTG诱导表达mIL-1β/SUMO融合蛋白,Ni-NTA Agarose纯化后,表达产物经SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定,用SUMO protease-1切去SUMO标签,经纯化并切去融合标签后获得成熟mIL-1β蛋白.用MTT方法检测目的蛋白对L929细胞的生物学活性.结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致,SDS-PAGE分析表明融合蛋白的相对分子质量为37 kD,切割后的成熟蛋白为17 kD,与理论值相符.且蛋白表达量高,主要以可溶形式存在.Western blot证实该蛋白为mIL-1β.成熟蛋白纯化产物纯度超过95%以上,通过MTT的方法检测证明其具有使L929细胞增殖的作用,从而说明其具有生物学活性.结论:利用大肠杆菌表达系统可高效可溶性表达高纯度的具有生物活性的mIL-1β蛋白.
目的:從LPS刺激過的小鼠胸腺細胞中剋隆IL-1β基因,通過原覈錶達,穫得具有生物活性的可溶性鼠源IL-1β蛋白,為深入研究和利用IL-1β基因奠定基礎.方法:提取LPS刺激的小鼠胸腺細胞總RNA,反轉錄成cDNA,以此為模闆,根據GenBank報道的mIL-1β序列設計引物,進行巢式PCR,得到成熟mIL-1β的編碼序列基因,併插入到原覈錶達載體pHisSUMO express中SUMO標籤的下遊,構建重組錶達載體pHisSUMO express-mIL-1β.將該載體轉化大腸桿菌Rosetta (DE3),IPTG誘導錶達mIL-1β/SUMO融閤蛋白,Ni-NTA Agarose純化後,錶達產物經SDS-PAGE和 Western blot進行鑒定,用SUMO protease-1切去SUMO標籤,經純化併切去融閤標籤後穫得成熟mIL-1β蛋白.用MTT方法檢測目的蛋白對L929細胞的生物學活性.結果:DNA測序證明所剋隆基因序列與GenBank報道的完全一緻,SDS-PAGE分析錶明融閤蛋白的相對分子質量為37 kD,切割後的成熟蛋白為17 kD,與理論值相符.且蛋白錶達量高,主要以可溶形式存在.Western blot證實該蛋白為mIL-1β.成熟蛋白純化產物純度超過95%以上,通過MTT的方法檢測證明其具有使L929細胞增殖的作用,從而說明其具有生物學活性.結論:利用大腸桿菌錶達繫統可高效可溶性錶達高純度的具有生物活性的mIL-1β蛋白.
목적:종LPS자격과적소서흉선세포중극륭IL-1β기인,통과원핵표체,획득구유생물활성적가용성서원IL-1β단백,위심입연구화이용IL-1β기인전정기출.방법:제취LPS자격적소서흉선세포총RNA,반전록성cDNA,이차위모판,근거GenBank보도적mIL-1β서렬설계인물,진행소식PCR,득도성숙mIL-1β적편마서렬기인,병삽입도원핵표체재체pHisSUMO express중SUMO표첨적하유,구건중조표체재체pHisSUMO express-mIL-1β.장해재체전화대장간균Rosetta (DE3),IPTG유도표체mIL-1β/SUMO융합단백,Ni-NTA Agarose순화후,표체산물경SDS-PAGE화 Western blot진행감정,용SUMO protease-1절거SUMO표첨,경순화병절거융합표첨후획득성숙mIL-1β단백.용MTT방법검측목적단백대L929세포적생물학활성.결과:DNA측서증명소극륭기인서렬여GenBank보도적완전일치,SDS-PAGE분석표명융합단백적상대분자질량위37 kD,절할후적성숙단백위17 kD,여이론치상부.차단백표체량고,주요이가용형식존재.Western blot증실해단백위mIL-1β.성숙단백순화산물순도초과95%이상,통과MTT적방법검측증명기구유사L929세포증식적작용,종이설명기구유생물학활성.결론:이용대장간균표체계통가고효가용성표체고순도적구유생물활성적mIL-1β단백.
