CAJ | 학술논문

为了克隆尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的氨基末端片段与纤溶酶原激活剂抑制物2型(PA1-2)突变体所构成的融合蛋白基因,并在Pichia pastoris中表达,应用PCR获得了人ATF-PAI2CD融合蛋白基因cDNA(简称ATF-PAI2CD),将其克隆到酵母表达载体pPIC9K,获得融合基因表达质粒pzwY-ATF-PAI2CD.该质粒转化毕赤酵母菌GS115,用G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,然后用甲醇诱导表达.工程菌用摇瓶发酵,表达产物ATF-PAI2CD占培养液中总蛋白50%以上.经硫酸铵沉淀、分子筛和离子交换层析纯化得到的目标表达产物纯度达95%.westem印迹检测具有PAI-2与uPA的免疫原性,经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性.经流式细胞仪(FCM)检测,能与肿瘤细胞特异性结合.结果表明,ATF-PAI2CD融合蛋白成功地在毕赤酵母中表达,且具有抑制uPA及与肿瘤细胞表面uPAR特异性结合的双重功能.提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景.
위료극륭뇨격매형섬용매원격활물(uPA)적안기말단편단여섬용매원격활제억제물2형(PA1-2)돌변체소구성적융합단백기인,병재Pichia pastoris중표체,응용PCR획득료인ATF-PAI2CD융합단백기인cDNA(간칭ATF-PAI2CD),장기극륭도효모표체재체pPIC9K,획득융합기인표체질립pzwY-ATF-PAI2CD.해질립전화필적효모균GS115,용G418-YPD평판사선고고패전화자,연후용갑순유도표체.공정균용요병발효,표체산물ATF-PAI2CD점배양액중총단백50%이상.경류산안침정、분자사화리자교환층석순화득도적목표표체산물순도체95%.westem인적검측구유PAI-2여uPA적면역원성,경우내판법검측구유섬용억제활성.경류식세포의(FCM)검측,능여종류세포특이성결합.결과표명,ATF-PAI2CD융합단백성공지재필적효모중표체,차구유억제uPA급여종류세포표면uPAR특이성결합적쌍중공능.제시해융합단백가능구유량호적응용전경.