中国药物与临床
中國藥物與臨床
중국약물여림상
CHINESE REMEDIES & CLINICS
2006年
8期
576-579
,共4页
郎旭宇%闫萍%王惠珍%张悦红%程牛亮%郭睿
郎旭宇%閆萍%王惠珍%張悅紅%程牛亮%郭睿
랑욱우%염평%왕혜진%장열홍%정우량%곽예
原癌基因%遗传载体%原核表达
原癌基因%遺傳載體%原覈錶達
원암기인%유전재체%원핵표체
目的 克隆小鼠Pokemon(POK eryhroid myeloid ontogenic factor)基因并进行原核表达及重组蛋白的纯化.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆人pGEM-T-easy载体,经鉴定后,以限制性核酸内切酶分别消化重组质粒及原核表达载体pET-30a(+),体外定向连接,进行PCR、内切酶酶切及DNA序列分析,阳性重组表达质粒进一步转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达,经Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,Western blotting检测其特异性.结果 限制性核酸酶切及序列分析表明重组表达质粒包含Pokemon基因编码区,阅读框架无移位;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有预期相对分子质量为36 000的重组蛋白表达,经亲和层析纯化后,融合蛋白的纯度达到90%以上;Western blotting印迹表明纯化的融合蛋白具有特异的免疫反应特性.结论 采用基因克隆技术成功构建了Pokemon原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,为后期抗体的制备及进一步研究该基因与肿瘤发生的关系奠定了基础.
目的 剋隆小鼠Pokemon(POK eryhroid myeloid ontogenic factor)基因併進行原覈錶達及重組蛋白的純化.方法 應用反轉錄聚閤酶鏈反應(RT-PCR)擴增目的基因片段,剋隆人pGEM-T-easy載體,經鑒定後,以限製性覈痠內切酶分彆消化重組質粒及原覈錶達載體pET-30a(+),體外定嚮連接,進行PCR、內切酶酶切及DNA序列分析,暘性重組錶達質粒進一步轉化到大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中誘導錶達,經Ni-NTA親和層析純化融閤蛋白,Western blotting檢測其特異性.結果 限製性覈痠酶切及序列分析錶明重組錶達質粒包含Pokemon基因編碼區,閱讀框架無移位;十二烷基磺痠鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示有預期相對分子質量為36 000的重組蛋白錶達,經親和層析純化後,融閤蛋白的純度達到90%以上;Western blotting印跡錶明純化的融閤蛋白具有特異的免疫反應特性.結論 採用基因剋隆技術成功構建瞭Pokemon原覈錶達載體,併穫得瞭高純度的重組蛋白,為後期抗體的製備及進一步研究該基因與腫瘤髮生的關繫奠定瞭基礎.
목적 극륭소서Pokemon(POK eryhroid myeloid ontogenic factor)기인병진행원핵표체급중조단백적순화.방법 응용반전록취합매련반응(RT-PCR)확증목적기인편단,극륭인pGEM-T-easy재체,경감정후,이한제성핵산내절매분별소화중조질립급원핵표체재체pET-30a(+),체외정향련접,진행PCR、내절매매절급DNA서렬분석,양성중조표체질립진일보전화도대장간균E.coli BL21(DE3)중유도표체,경Ni-NTA친화층석순화융합단백,Western blotting검측기특이성.결과 한제성핵산매절급서렬분석표명중조표체질립포함Pokemon기인편마구,열독광가무이위;십이완기광산납-취병희선알응효전영(SDS-PAGE)현시유예기상대분자질량위36 000적중조단백표체,경친화층석순화후,융합단백적순도체도90%이상;Western blotting인적표명순화적융합단백구유특이적면역반응특성.결론 채용기인극륭기술성공구건료Pokemon원핵표체재체,병획득료고순도적중조단백,위후기항체적제비급진일보연구해기인여종류발생적관계전정료기출.
