中国分子心脏病学杂志
中國分子心髒病學雜誌
중국분자심장병학잡지
MOLECULAR CARDIOLOGY OF CHINA
2007年
5期
272-276
,共5页
丁虎%李仁立%卢志南%汪道文
丁虎%李仁立%盧誌南%汪道文
정호%리인립%로지남%왕도문
CYP4F2%基因克隆%突变%表达%纯化
CYP4F2%基因剋隆%突變%錶達%純化
CYP4F2%기인극륭%돌변%표체%순화
目的 构建人细胞色素P450 4F2基因野生型、V81G和V433M突变型表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化出CYP4F2蛋白.方法 用RT-PCR方法从人肾脏总RNA中逆转录扩增CYP4F2,将其插入克隆载体pMD18-T Simple Vector中,将测序鉴正确的CYP4F2基因N、C端改造,克隆构建重组表达载体pCWori+-CYP4F2(His)4-WT.同时采用重叠PCR定点突变法构建pCWori+-CYP4F2 V81G(His)4和pCWori+-CYP4F2 V433M(His)4表达载体,分别转化至E.Coli XL-Blue中表达.结果 经IPTG诱导可有效表达CYP4F2和突变体V81G与V433M,经Western blot分析可以观察到分子量为57 kD的诱导表达条带,该表达蛋白可与His-Probe多克隆抗体起特异反应.用His-bind亲和层析纯化得到了纯度较高的His融合蛋白.结论 用基因工程技术在大肠杆菌中有效表达人CYP4F2基因野生型、V81G和V433M突变型蛋白、并得到了纯度较高的CYP4F2蛋白,为进一步研究其生物学功能及研制相应抗体奠定了基础.
目的 構建人細胞色素P450 4F2基因野生型、V81G和V433M突變型錶達載體,在大腸桿菌中錶達併純化齣CYP4F2蛋白.方法 用RT-PCR方法從人腎髒總RNA中逆轉錄擴增CYP4F2,將其插入剋隆載體pMD18-T Simple Vector中,將測序鑒正確的CYP4F2基因N、C耑改造,剋隆構建重組錶達載體pCWori+-CYP4F2(His)4-WT.同時採用重疊PCR定點突變法構建pCWori+-CYP4F2 V81G(His)4和pCWori+-CYP4F2 V433M(His)4錶達載體,分彆轉化至E.Coli XL-Blue中錶達.結果 經IPTG誘導可有效錶達CYP4F2和突變體V81G與V433M,經Western blot分析可以觀察到分子量為57 kD的誘導錶達條帶,該錶達蛋白可與His-Probe多剋隆抗體起特異反應.用His-bind親和層析純化得到瞭純度較高的His融閤蛋白.結論 用基因工程技術在大腸桿菌中有效錶達人CYP4F2基因野生型、V81G和V433M突變型蛋白、併得到瞭純度較高的CYP4F2蛋白,為進一步研究其生物學功能及研製相應抗體奠定瞭基礎.
목적 구건인세포색소P450 4F2기인야생형、V81G화V433M돌변형표체재체,재대장간균중표체병순화출CYP4F2단백.방법 용RT-PCR방법종인신장총RNA중역전록확증CYP4F2,장기삽입극륭재체pMD18-T Simple Vector중,장측서감정학적CYP4F2기인N、C단개조,극륭구건중조표체재체pCWori+-CYP4F2(His)4-WT.동시채용중첩PCR정점돌변법구건pCWori+-CYP4F2 V81G(His)4화pCWori+-CYP4F2 V433M(His)4표체재체,분별전화지E.Coli XL-Blue중표체.결과 경IPTG유도가유효표체CYP4F2화돌변체V81G여V433M,경Western blot분석가이관찰도분자량위57 kD적유도표체조대,해표체단백가여His-Probe다극륭항체기특이반응.용His-bind친화층석순화득도료순도교고적His융합단백.결론 용기인공정기술재대장간균중유효표체인CYP4F2기인야생형、V81G화V433M돌변형단백、병득도료순도교고적CYP4F2단백,위진일보연구기생물학공능급연제상응항체전정료기출.
