微生物学报
微生物學報
미생물학보
ACTA MICROBIOLOGICA SINICA
2005年
1期
34-38
,共5页
多拷贝表达载体%人脑源性神经营养因子%毕赤酵母%分泌表达
多拷貝錶達載體%人腦源性神經營養因子%畢赤酵母%分泌錶達
다고패표체재체%인뇌원성신경영양인자%필적효모%분비표체
利用PCR技术扩增出pPIC9K载体的HIS4-Kan序列片段,与pPICZα重组,构建结合了两个载体特点的适合体外构建多拷贝基因表达盒的毕赤酵母表达载体pPICZα1,改造后的载体含HIS4-Kan序列,能整合到酵母染色体上,具有筛选方便、外源基因多拷贝组建迅速、蛋白产物分泌表达和易纯化等优点.将人脑源性神经营养因子(hBDNF)的cDNA(357bp)克隆入载体pPICZα1,利用同尾酶BglⅡ、BamHⅠ不可逆连接方式,分别构建含有1、2、3、6个拷贝hBDNF表达盒的重组表达载体,电击法转化毕赤酵母GS115菌株,用G418和Zeocin筛选转化子,筛选到的阳性转化子用0.5%甲醇诱导,获得分泌型表达.表达产物类似于天然神经营养因子单体大小、分子量约14kD.多拷贝hBDNF表达盒的表达水平亦高于单拷贝hBDNF表达盒,ELISA和Western blot检测表明:表达的蛋白能与鸡抗人脑源性神经营养因子抗体特异结合,证实该表达蛋白具有hBDNF的免疫原性.
利用PCR技術擴增齣pPIC9K載體的HIS4-Kan序列片段,與pPICZα重組,構建結閤瞭兩箇載體特點的適閤體外構建多拷貝基因錶達盒的畢赤酵母錶達載體pPICZα1,改造後的載體含HIS4-Kan序列,能整閤到酵母染色體上,具有篩選方便、外源基因多拷貝組建迅速、蛋白產物分泌錶達和易純化等優點.將人腦源性神經營養因子(hBDNF)的cDNA(357bp)剋隆入載體pPICZα1,利用同尾酶BglⅡ、BamHⅠ不可逆連接方式,分彆構建含有1、2、3、6箇拷貝hBDNF錶達盒的重組錶達載體,電擊法轉化畢赤酵母GS115菌株,用G418和Zeocin篩選轉化子,篩選到的暘性轉化子用0.5%甲醇誘導,穫得分泌型錶達.錶達產物類似于天然神經營養因子單體大小、分子量約14kD.多拷貝hBDNF錶達盒的錶達水平亦高于單拷貝hBDNF錶達盒,ELISA和Western blot檢測錶明:錶達的蛋白能與鷄抗人腦源性神經營養因子抗體特異結閤,證實該錶達蛋白具有hBDNF的免疫原性.
이용PCR기술확증출pPIC9K재체적HIS4-Kan서렬편단,여pPICZα중조,구건결합료량개재체특점적괄합체외구건다고패기인표체합적필적효모표체재체pPICZα1,개조후적재체함HIS4-Kan서렬,능정합도효모염색체상,구유사선방편、외원기인다고패조건신속、단백산물분비표체화역순화등우점.장인뇌원성신경영양인자(hBDNF)적cDNA(357bp)극륭입재체pPICZα1,이용동미매BglⅡ、BamHⅠ불가역련접방식,분별구건함유1、2、3、6개고패hBDNF표체합적중조표체재체,전격법전화필적효모GS115균주,용G418화Zeocin사선전화자,사선도적양성전화자용0.5%갑순유도,획득분비형표체.표체산물유사우천연신경영양인자단체대소、분자량약14kD.다고패hBDNF표체합적표체수평역고우단고패hBDNF표체합,ELISA화Western blot검측표명:표체적단백능여계항인뇌원성신경영양인자항체특이결합,증실해표체단백구유hBDNF적면역원성.
