中国现代医药杂志
中國現代醫藥雜誌
중국현대의약잡지
MODERN MEDICINE JOURNAL OF CHINA
2007年
9期
4-8
,共5页
反义%质粒%尿激酶受体
反義%質粒%尿激酶受體
반의%질립%뇨격매수체
目的 构建尿激酶受体(UPAR)基因pcDNA3.1(-)真核表达质粒,为进一步研究通过UPAR干预类风湿关节炎的发生发展提供实验基础.方法 取冰冻保存的小鼠肝癌组织,应用TRIzol法提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度.使用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒获得目的 基因(UPAR)cDNA片段.用CaCl2法诱导感受态细胞.将真核载体pcDNA3.1(-)在多克隆位点处用HindⅢ、BamH Ⅰ双酶切线性化,切胶纯化回收;将纯化回收的pcDNA3.1(-)线性化载体和UPAR基因片段定向及反向连接,构建以pcDNA3.1(-)为载体的反义UPAR基因表达质粒;转化JM109大肠杆菌;酶切证实的阳性克隆行测序分析.结果 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,见28S,18S条带完整,而且28S条带亮度为18S的1倍左右,认为RNA完整性良好,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA纯度A260/A280=1.9051,认为RNA纯度良好;RNA浓度为450mg/L;阳性克隆经双酶切后行10g/L琼脂糖电泳,在DNA Marker 500bp和5.3bp附近可见两条明显条带,与所需目的片段大小相符,证实为阳性克隆,重组质粒构建成功;DNA测序结果与预期目的 片段序列一致.结论 反义UPAR真核表达重组质粒构建成功.
目的 構建尿激酶受體(UPAR)基因pcDNA3.1(-)真覈錶達質粒,為進一步研究通過UPAR榦預類風濕關節炎的髮生髮展提供實驗基礎.方法 取冰凍保存的小鼠肝癌組織,應用TRIzol法提取總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,併用紫外分光覈痠蛋白分析儀測定RNA濃度和純度.使用一步法逆轉錄聚閤酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒穫得目的 基因(UPAR)cDNA片段.用CaCl2法誘導感受態細胞.將真覈載體pcDNA3.1(-)在多剋隆位點處用HindⅢ、BamH Ⅰ雙酶切線性化,切膠純化迴收;將純化迴收的pcDNA3.1(-)線性化載體和UPAR基因片段定嚮及反嚮連接,構建以pcDNA3.1(-)為載體的反義UPAR基因錶達質粒;轉化JM109大腸桿菌;酶切證實的暘性剋隆行測序分析.結果 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,見28S,18S條帶完整,而且28S條帶亮度為18S的1倍左右,認為RNA完整性良好,併用紫外分光覈痠蛋白分析儀測定RNA純度A260/A280=1.9051,認為RNA純度良好;RNA濃度為450mg/L;暘性剋隆經雙酶切後行10g/L瓊脂糖電泳,在DNA Marker 500bp和5.3bp附近可見兩條明顯條帶,與所需目的片段大小相符,證實為暘性剋隆,重組質粒構建成功;DNA測序結果與預期目的 片段序列一緻.結論 反義UPAR真覈錶達重組質粒構建成功.
목적 구건뇨격매수체(UPAR)기인pcDNA3.1(-)진핵표체질립,위진일보연구통과UPAR간예류풍습관절염적발생발전제공실험기출.방법 취빙동보존적소서간암조직,응용TRIzol법제취총RNA,경지당응효전영검측RNA완정성,병용자외분광핵산단백분석의측정RNA농도화순도.사용일보법역전록취합매련반응(RT-PCR)시제합획득목적 기인(UPAR)cDNA편단.용CaCl2법유도감수태세포.장진핵재체pcDNA3.1(-)재다극륭위점처용HindⅢ、BamH Ⅰ쌍매절선성화,절효순화회수;장순화회수적pcDNA3.1(-)선성화재체화UPAR기인편단정향급반향련접,구건이pcDNA3.1(-)위재체적반의UPAR기인표체질립;전화JM109대장간균;매절증실적양성극륭행측서분석.결과 경지당응효전영검측RNA완정성,견28S,18S조대완정,이차28S조대량도위18S적1배좌우,인위RNA완정성량호,병용자외분광핵산단백분석의측정RNA순도A260/A280=1.9051,인위RNA순도량호;RNA농도위450mg/L;양성극륭경쌍매절후행10g/L경지당전영,재DNA Marker 500bp화5.3bp부근가견량조명현조대,여소수목적편단대소상부,증실위양성극륭,중조질립구건성공;DNA측서결과여예기목적 편단서렬일치.결론 반의UPAR진핵표체중조질립구건성공.
