农业生物技术学报
農業生物技術學報
농업생물기술학보
JOURNAL OF AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY
2010年
3期
526-532
,共7页
陈冬梅%吕长荣%辛晓玲%窦忠英
陳鼕梅%呂長榮%辛曉玲%竇忠英
진동매%려장영%신효령%두충영
Oct4基因%克隆%逆转录病毒载体pMSCV%牛
Oct4基因%剋隆%逆轉錄病毒載體pMSCV%牛
Oct4기인%극륭%역전록병독재체pMSCV%우
为了克隆奶牛Oct4基因开放性阅读框全序列,并建立高效、稳定产生逆转录病毒质粒pMSCV-Oct4的包装细胞株.我们以50～60日龄的胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR的方法扩增出牛Oct4基因全序列,全长为1 083 bp与GenBank公布的序列的同源性为99.4%.将其插入到逆转录病毒载体pMSCVneo的多克隆位点,获得重组逆转录病毒质粒pMSCVneo-Oct4.鉴定正确后,通过Lipofectamine2000将其转导入包装细胞PT67,用含有G418的培养液进行抗性筛选,获得阳性细胞克隆.细胞上清经过RT-PCR、透射电镜及病毒滴度测定等方法鉴定,证实所包装病毒存在,其滴度值为8.83×107 cfu/mL.试验结果表明我们已获得携带牛Oct4基因的高滴度感染性逆转录病毒.
為瞭剋隆奶牛Oct4基因開放性閱讀框全序列,併建立高效、穩定產生逆轉錄病毒質粒pMSCV-Oct4的包裝細胞株.我們以50～60日齡的胎牛原始生殖嵴為材料,用RT-PCR的方法擴增齣牛Oct4基因全序列,全長為1 083 bp與GenBank公佈的序列的同源性為99.4%.將其插入到逆轉錄病毒載體pMSCVneo的多剋隆位點,穫得重組逆轉錄病毒質粒pMSCVneo-Oct4.鑒定正確後,通過Lipofectamine2000將其轉導入包裝細胞PT67,用含有G418的培養液進行抗性篩選,穫得暘性細胞剋隆.細胞上清經過RT-PCR、透射電鏡及病毒滴度測定等方法鑒定,證實所包裝病毒存在,其滴度值為8.83×107 cfu/mL.試驗結果錶明我們已穫得攜帶牛Oct4基因的高滴度感染性逆轉錄病毒.
위료극륭내우Oct4기인개방성열독광전서렬,병건립고효、은정산생역전록병독질립pMSCV-Oct4적포장세포주.아문이50～60일령적태우원시생식척위재료,용RT-PCR적방법확증출우Oct4기인전서렬,전장위1 083 bp여GenBank공포적서렬적동원성위99.4%.장기삽입도역전록병독재체pMSCVneo적다극륭위점,획득중조역전록병독질립pMSCVneo-Oct4.감정정학후,통과Lipofectamine2000장기전도입포장세포PT67,용함유G418적배양액진행항성사선,획득양성세포극륭.세포상청경과RT-PCR、투사전경급병독적도측정등방법감정,증실소포장병독존재,기적도치위8.83×107 cfu/mL.시험결과표명아문이획득휴대우Oct4기인적고적도감염성역전록병독.
