CAJ | 학술논문

Ⅰ型内含子核酶经过设计特定的信号引导序列(IGS),可特异性地定点剪接目的基因RNA,从而在RNA水平达到修复病变基因的目的.以四膜虫材料,克隆了其26S rRNA内含子核酶基因,体外转录证实该Ⅰ型内含子核酶具有完全的自我剪接的功能.为检测该核酶的反式剪接功能,构建了缺失后半段564bp基因序列的绿色荧光蛋白(GFP)的截短突变体重组质粒XYQ5/XYQ10-pEGFP-C2,并证实其失去了发射绿色荧光的活性.利用PCR和分子克隆技术,构建了以上EGFP突变体的反式剪接修复核酶ptrans-rib-CMV2,该核酶载体以克隆的26S RNA内含子为核心,选择EGFP编码区194位T-G为剪接位点,以188-193位设计IGS序列,核酶3′端携带195-890bp的EGFP基因序列,连接于pRC-CMV2真核表达载体中.体外转录突变EGFP的原核表达载体XYQ5/10-pGEM和ptrans-rib-CMV2,以混合转录产物为模板进行RT-PCR,电泳及测序证实产物中含有反式剪接修复的野生型EGFP mRNA,从而证实构建的反式剪接核酶具有体外反式剪接功能.将截短突变重组质粒XYQ5/XYQ10-pEGFP-C2与核酶质粒ptrans-rib-CMV2共转染Hela细胞,用荧光显微镜观察转染结果,发现有少量共转染的Hela细胞发出绿光;RT-PCR检测出野生型EGFP mRNA,证明构建的反式剪接核酶具有体内反式剪接的功能,但其反式剪接效率低.
Ⅰ형내함자핵매경과설계특정적신호인도서렬(IGS),가특이성지정점전접목적기인RNA,종이재RNA수평체도수복병변기인적목적.이사막충재료,극륭료기26S rRNA내함자핵매기인,체외전록증실해Ⅰ형내함자핵매구유완전적자아전접적공능.위검측해핵매적반식전접공능,구건료결실후반단564bp기인서렬적록색형광단백(GFP)적절단돌변체중조질립XYQ5/XYQ10-pEGFP-C2,병증실기실거료발사록색형광적활성.이용PCR화분자극륭기술,구건료이상EGFP돌변체적반식전접수복핵매ptrans-rib-CMV2,해핵매재체이극륭적26S RNA내함자위핵심,선택EGFP편마구194위T-G위전접위점,이188-193위설계IGS서렬,핵매3′단휴대195-890bp적EGFP기인서렬,련접우pRC-CMV2진핵표체재체중.체외전록돌변EGFP적원핵표체재체XYQ5/10-pGEM화ptrans-rib-CMV2,이혼합전록산물위모판진행RT-PCR,전영급측서증실산물중함유반식전접수복적야생형EGFP mRNA,종이증실구건적반식전접핵매구유체외반식전접공능.장절단돌변중조질립XYQ5/XYQ10-pEGFP-C2여핵매질립ptrans-rib-CMV2공전염Hela세포,용형광현미경관찰전염결과,발현유소량공전염적Hela세포발출록광;RT-PCR검측출야생형EGFP mRNA,증명구건적반식전접핵매구유체내반식전접적공능,단기반식전접효솔저.