CAJ | 학술논문

应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制Rapl基因的表达,构建Rap1 shRNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体,观察其对小鼠肝脏细胞中Rap1 mRNA和蛋白表达的干扰作用.根据小鼠Rap1 mRNA的全序列.设计了3种Rap1 siRNA序列(Rap1 siRNA1、Rap1 siRNA2、Rap1 siRNA3)和阴性对照序列(HK);采用克隆技术,将其插入带有报告基因绿色荧光(ECFP)的pGenesil-3栽体,构建Rap1 shRNA表达载体:经双酶切和测序证实Rap1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;昆明小鼠40只,体重18～20 g,随机分成4组: Ⅰ组(转染HK组)、Ⅱ组(转染Rapl shRNAl组)、Ⅲ组(转染Rap1 shRNA2组)、Ⅳ组(转染Rapl shRNA3组).于0、16、24 h腹腔内注射Rapl shRNA 2.0～2.5 mg/kg(用PBS稀释至1 mL);48 h后收集小鼠肝脏.用显微荧光、定量RT-PCT、免疫组化检测小鼠肝细胞中Rap1shRNA的转染率、Rap1基因表达以及蛋白质表达水平.Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组小鼠肝脏细胞体内转染率均大于60%,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组的Rap1 mRNA表达、Rap1蛋白表达均降低,其中Rap1 shRNA1干扰效果最佳.
응용RNA간우(RNA interference,RNAi)기술억제Rapl기인적표체,구건Rap1 shRNA(small hairpin RNA,shRNA)표체재체,관찰기대소서간장세포중Rap1 mRNA화단백표체적간우작용.근거소서Rap1 mRNA적전서렬.설계료3충Rap1 siRNA서렬(Rap1 siRNA1、Rap1 siRNA2、Rap1 siRNA3)화음성대조서렬(HK);채용극륭기술,장기삽입대유보고기인록색형광(ECFP)적pGenesil-3재체,구건Rap1 shRNA표체재체:경쌍매절화측서증실Rap1 siRNA표체재체극륭구건성공,삽입편단측서결과여합성적siRNA결과일치;곤명소서40지,체중18～20 g,수궤분성4조: Ⅰ조(전염HK조)、Ⅱ조(전염Rapl shRNAl조)、Ⅲ조(전염Rap1 shRNA2조)、Ⅳ조(전염Rapl shRNA3조).우0、16、24 h복강내주사Rapl shRNA 2.0～2.5 mg/kg(용PBS희석지1 mL);48 h후수집소서간장.용현미형광、정량RT-PCT、면역조화검측소서간세포중Rap1shRNA적전염솔、Rap1기인표체이급단백질표체수평.Ⅰ조、Ⅱ조、Ⅲ조、Ⅳ조소서간장세포체내전염솔균대우60%,Ⅱ조、Ⅲ조、Ⅳ조적Rap1 mRNA표체、Rap1단백표체균강저,기중Rap1 shRNA1간우효과최가.