解放军医学杂志
解放軍醫學雜誌
해방군의학잡지
MEDICAL JOURNAL OF CHINESE PEOPLE'S LIBERATION ARMY
2005年
2期
127-129
,共3页
王春花%成军%闫惠平%闫杰%石英%程胜禹
王春花%成軍%閆惠平%閆傑%石英%程勝禹
왕춘화%성군%염혜평%염걸%석영%정성우
抑制性消减杂交%克隆%XTP3%反式激活
抑製性消減雜交%剋隆%XTP3%反式激活
억제성소감잡교%극륭%XTP3%반식격활
目的应用抑制性消减杂交技术构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减文库,克隆XTP3反式激活相关基因.方法以XTP3表达质粒pcDNA3.1(-)-XTP3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果文库扩增后得到30个白色克隆,经菌落PCR分析,得到23个200～1 000bp插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,共得到20种已知基因序列和2种未知功能基因序列,可能是XTP3反式激活靶基因. 结论成功构建了乙型肝炎病毒XTP3反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定了基础.
目的應用抑製性消減雜交技術構建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的差異錶達的cDNA消減文庫,剋隆XTP3反式激活相關基因.方法以XTP3錶達質粒pcDNA3.1(-)-XTP3轉染HepG2細胞,以空載體pcDNA3.1(-)為對照;製備轉染後的細胞裂解液,提取mRNA併逆轉錄為cDNA,經Rsa Ⅰ酶切後,將實驗組cDNA分成兩組,分彆與兩種不同的接頭銜接,再與對照組cDNA進行兩次消減雜交及兩次抑製性PCR,將產物與T/A載體連接,構建cDNA消減文庫,併轉染大腸桿菌進行文庫擴增,隨機挑選剋隆PCR擴增後進行測序及同源性分析. 結果文庫擴增後得到30箇白色剋隆,經菌落PCR分析,得到23箇200～1 000bp插入片段.對所得片段測序,併進行同源性分析,共得到20種已知基因序列和2種未知功能基因序列,可能是XTP3反式激活靶基因. 結論成功構建瞭乙型肝炎病毒XTP3反式激活基因差異錶達的cDNA消減文庫,為今後進一步分析、研究病毒蛋白的緻病機製奠定瞭基礎.
목적응용억제성소감잡교기술구건을형간염병독X단백반식격활기인XTP3적차이표체적cDNA소감문고,극륭XTP3반식격활상관기인.방법이XTP3표체질립pcDNA3.1(-)-XTP3전염HepG2세포,이공재체pcDNA3.1(-)위대조;제비전염후적세포렬해액,제취mRNA병역전록위cDNA,경Rsa Ⅰ매절후,장실험조cDNA분성량조,분별여량충불동적접두함접,재여대조조cDNA진행량차소감잡교급량차억제성PCR,장산물여T/A재체련접,구건cDNA소감문고,병전염대장간균진행문고확증,수궤도선극륭PCR확증후진행측서급동원성분석. 결과문고확증후득도30개백색극륭,경균락PCR분석,득도23개200～1 000bp삽입편단.대소득편단측서,병진행동원성분석,공득도20충이지기인서렬화2충미지공능기인서렬,가능시XTP3반식격활파기인. 결론성공구건료을형간염병독XTP3반식격활기인차이표체적cDNA소감문고,위금후진일보분석、연구병독단백적치병궤제전정료기출.
