南京师大学报（自然科学版）
南京師大學報（自然科學版）
남경사대학보（자연과학판）
JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE EDITION)
2011年
4期
83-88
,共6页
来珊珊%陈卫波%徐康%丁尧%沈宁%潘飞燕%李朝军%薛斌
來珊珊%陳衛波%徐康%丁堯%瀋寧%潘飛燕%李朝軍%薛斌
래산산%진위파%서강%정요%침저%반비연%리조군%설빈
GGPPS%重组腺病毒%肝星状细胞
GGPPS%重組腺病毒%肝星狀細胞
GGPPS%중조선병독%간성상세포
目的:构建携带人源ggpps基因的重组腺病毒并用其研究GGPPS对人肝星状细胞的活化作用.方法:利用PCR方法扩增ggpps基因片段,并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成穿梭质粒pAdTrack-CMV-GGPPS.测序正确后,经PmeⅠ单酶切线性化的pAdTrack-CMV-GGPPS与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电穿孔法共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组.经PacⅠ酶切鉴定正确后,用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组体腺病毒Ad-GGPPS颗粒.利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中GFP报告基因的表达,观察重组腺病毒的产生.用TCID50法测定病毒颗粒的浓度,并用免疫蛋白印迹和实时荧光定量PCR方法鉴定目的基因的表达.然后利用该病毒感染人肝星状细胞LX-2,观察对肝星状细胞的活化以及细胞外基质合成的影响.结果:成功地构建了携带ggpps基因的重组腺病毒,得到的病毒滴度经TCID50法检测为2.5×109 PFU/mL.该病毒能够在人源的肝脏细胞中成功表达GGPPS蛋白.在LX-2细胞中过量表达GGPPS可以促进肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)转分化成表达平滑肌肌动蛋白α(Alpha-Smooth muscle actin,α-SMA)的肌成纤维细胞(Myofibroblast,MF),同时检测到胞外基质成分纤连蛋白( Fibronectin,FN)的表达量显著增加.结论:成功构建的重组GGPPS腺病毒能促进肝星状细胞的活化.
目的:構建攜帶人源ggpps基因的重組腺病毒併用其研究GGPPS對人肝星狀細胞的活化作用.方法:利用PCR方法擴增ggpps基因片段,併亞剋隆至腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV中,形成穿梭質粒pAdTrack-CMV-GGPPS.測序正確後,經PmeⅠ單酶切線性化的pAdTrack-CMV-GGPPS與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1用電穿孔法共轉化大腸桿菌BJ5183,進行同源重組.經PacⅠ酶切鑒定正確後,用燐痠鈣法轉染QBI-293A細胞,包裝成重組體腺病毒Ad-GGPPS顆粒.利用穿梭質粒pAdTrack-CMV中GFP報告基因的錶達,觀察重組腺病毒的產生.用TCID50法測定病毒顆粒的濃度,併用免疫蛋白印跡和實時熒光定量PCR方法鑒定目的基因的錶達.然後利用該病毒感染人肝星狀細胞LX-2,觀察對肝星狀細胞的活化以及細胞外基質閤成的影響.結果:成功地構建瞭攜帶ggpps基因的重組腺病毒,得到的病毒滴度經TCID50法檢測為2.5×109 PFU/mL.該病毒能夠在人源的肝髒細胞中成功錶達GGPPS蛋白.在LX-2細胞中過量錶達GGPPS可以促進肝星狀細胞(Hepatic stellate cells,HSCs)轉分化成錶達平滑肌肌動蛋白α(Alpha-Smooth muscle actin,α-SMA)的肌成纖維細胞(Myofibroblast,MF),同時檢測到胞外基質成分纖連蛋白( Fibronectin,FN)的錶達量顯著增加.結論:成功構建的重組GGPPS腺病毒能促進肝星狀細胞的活化.
목적:구건휴대인원ggpps기인적중조선병독병용기연구GGPPS대인간성상세포적활화작용.방법:이용PCR방법확증ggpps기인편단,병아극륭지선병독천사질립pAdTrack-CMV중,형성천사질립pAdTrack-CMV-GGPPS.측서정학후,경PmeⅠ단매절선성화적pAdTrack-CMV-GGPPS여선병독골가질립pAdEasy-1용전천공법공전화대장간균BJ5183,진행동원중조.경PacⅠ매절감정정학후,용린산개법전염QBI-293A세포,포장성중조체선병독Ad-GGPPS과립.이용천사질립pAdTrack-CMV중GFP보고기인적표체,관찰중조선병독적산생.용TCID50법측정병독과립적농도,병용면역단백인적화실시형광정량PCR방법감정목적기인적표체.연후이용해병독감염인간성상세포LX-2,관찰대간성상세포적활화이급세포외기질합성적영향.결과:성공지구건료휴대ggpps기인적중조선병독,득도적병독적도경TCID50법검측위2.5×109 PFU/mL.해병독능구재인원적간장세포중성공표체GGPPS단백.재LX-2세포중과량표체GGPPS가이촉진간성상세포(Hepatic stellate cells,HSCs)전분화성표체평활기기동단백α(Alpha-Smooth muscle actin,α-SMA)적기성섬유세포(Myofibroblast,MF),동시검측도포외기질성분섬련단백( Fibronectin,FN)적표체량현저증가.결론:성공구건적중조GGPPS선병독능촉진간성상세포적활화.
