中国预防兽医学报
中國預防獸醫學報
중국예방수의학보
CHINESE JOURNAL OF PREVENTIVE VETERINARY MEDICINE
2008年
1期
30-34,52
,共6页
赵艳敏%刘惠莉%邢继兰%潘洁%曹祥荣
趙豔敏%劉惠莉%邢繼蘭%潘潔%曹祥榮
조염민%류혜리%형계란%반길%조상영
大肠杆菌不耐热肠毒素%突变体%表达
大腸桿菌不耐熱腸毒素%突變體%錶達
대장간균불내열장독소%돌변체%표체
利用重叠延伸PCR扩增技术,体外获得大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)突变体LTK63、LTR72和LTG192全基因片段,酶切和测序结果表明构建的表达载体pET30a-LT、pET30a-LTK63、pET30a-LTR72、pET30a-LTG192阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换.诱导表达产物用SDS-PAGE检测,野生型LT蛋白及3个突变体均表达出约33.0 Ku和13.0 Ku的2个蛋白带,与LTA、LTB亚基分子量大小相吻合;Western blot检测,2个蛋白带均可与抗His抗体发生特异性免疫反应,而13.0 Ku的蛋白带还可与抗霍乱毒素(CT)抗体发生免疫学反应.ADP-核糖转移酶活性试验分析,各突变体蛋白酶活性均低于野生型LT蛋白,但仍保留一些酶活性.Patent-mouse毒性试验检测,LTK63、LTR72和LTG192突变体蛋白的毒性均有不同程度降低,LTK63毒性降低最显著,LTG192蛋白毒性相对较大.
利用重疊延伸PCR擴增技術,體外穫得大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)突變體LTK63、LTR72和LTG192全基因片段,酶切和測序結果錶明構建的錶達載體pET30a-LT、pET30a-LTK63、pET30a-LTR72、pET30a-LTG192閱讀框架正確,且相應位點氨基痠穫得瞭替換.誘導錶達產物用SDS-PAGE檢測,野生型LT蛋白及3箇突變體均錶達齣約33.0 Ku和13.0 Ku的2箇蛋白帶,與LTA、LTB亞基分子量大小相吻閤;Western blot檢測,2箇蛋白帶均可與抗His抗體髮生特異性免疫反應,而13.0 Ku的蛋白帶還可與抗霍亂毒素(CT)抗體髮生免疫學反應.ADP-覈糖轉移酶活性試驗分析,各突變體蛋白酶活性均低于野生型LT蛋白,但仍保留一些酶活性.Patent-mouse毒性試驗檢測,LTK63、LTR72和LTG192突變體蛋白的毒性均有不同程度降低,LTK63毒性降低最顯著,LTG192蛋白毒性相對較大.
이용중첩연신PCR확증기술,체외획득대장간균불내열장독소(LT)돌변체LTK63、LTR72화LTG192전기인편단,매절화측서결과표명구건적표체재체pET30a-LT、pET30a-LTK63、pET30a-LTR72、pET30a-LTG192열독광가정학,차상응위점안기산획득료체환.유도표체산물용SDS-PAGE검측,야생형LT단백급3개돌변체균표체출약33.0 Ku화13.0 Ku적2개단백대,여LTA、LTB아기분자량대소상문합;Western blot검측,2개단백대균가여항His항체발생특이성면역반응,이13.0 Ku적단백대환가여항곽란독소(CT)항체발생면역학반응.ADP-핵당전이매활성시험분석,각돌변체단백매활성균저우야생형LT단백,단잉보류일사매활성.Patent-mouse독성시험검측,LTK63、LTR72화LTG192돌변체단백적독성균유불동정도강저,LTK63독성강저최현저,LTG192단백독성상대교대.
