CAJ | 학술논문

目的构建和鉴定结核分枝杆菌(MTB)重组双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum, Bb)-ESAT-6疫苗,研究该疫苗对鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因;将该基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-ESAT-6;用电穿孔法将该质粒导入Bb及BL21(DE3),构建结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗.用IPTG诱导重组BL21(DE3)菌表达ESAT-6/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定.65只BALB/c雌性小鼠,随机分为5组:A组(SC)、B组(IM)、C组(IN)、D组(Bb)、E组(PBS).分别于免疫后8周用5×105CFU MTB H37Ra减毒株悬浮于10μL PBS中进行鼻腔粘膜接种感染.攻击感染后6w剖杀各组小鼠8只,计数肝、肺组织荷菌量,常规ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE, MTT法检测特异性脾淋巴细胞增殖.结果 PCR成功扩增出288bp的ESAT-6基因;双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6疫苗构建成功.免疫印迹分析发现重组质粒pGEX-ESAT-6的表达产物在相对分子量(35kDa)处有明显的蛋白表达条带,表达效率为20%,且能被活动性结核病人血清特异识别.鼻腔内接种组的肝、肺组织荷菌量明显低于其他免疫组.疫苗接种组IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b明显升高,IgG3和IgE无明显变化;疫苗接种组的脾淋巴细胞明显增殖.结论成功构建了结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗,重组Bb-ESAT-6疫苗在抗结核分枝杆菌感染过程中具有一定免疫保护作用.
목적 구건화감정결핵분지간균(MTB)중조쌍기간균(Bifidobacteria bifidum, Bb)-ESAT-6역묘,연구해역묘대서결핵간균감염적면역보호효과.방법 이결핵분지간균H37Rv표준주기인조DNA위모판,통과PCR확증득도ESAT-6항원편마기인;장해기인정향극륭도대장애희균-쌍기간균천사표체재체pGEX-1λT,구건중조질립pGEX-ESAT-6;용전천공법장해질립도입Bb급BL21(DE3),구건결핵분지간균중조Bb-ESAT-6역묘.용IPTG유도중조BL21(DE3)균표체ESAT-6/GST융합단백;SDS-PAGE급Western blot대표체산물진행감정.65지BALB/c자성소서,수궤분위5조:A조(SC)、B조(IM)、C조(IN)、D조(Bb)、E조(PBS).분별우면역후8주용5×105CFU MTB H37Ra감독주현부우10μL PBS중진행비강점막접충감염.공격감염후6w부살각조소서8지,계수간、폐조직하균량,상규ELISA검측혈청IgG급기아류화IgE, MTT법검측특이성비림파세포증식.결과 PCR성공확증출288bp적ESAT-6기인;쌍매절증실ESAT6기인성공삽입pGEX-1λT중;PCR증실rBb-ESAT-6역묘구건성공.면역인적분석발현중조질립pGEX-ESAT-6적표체산물재상대분자량(35kDa)처유명현적단백표체조대,표체효솔위20%,차능피활동성결핵병인혈청특이식별.비강내접충조적간、폐조직하균량명현저우기타면역조.역묘접충조IgG、IgG1、IgG2a화IgG2b명현승고,IgG3화IgE무명현변화;역묘접충조적비림파세포명현증식.결론 성공구건료결핵분지간균중조Bb-ESAT-6역묘,중조Bb-ESAT-6역묘재항결핵분지간균감염과정중구유일정면역보호작용.