蚌埠医学院学报
蚌埠醫學院學報
방부의학원학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE BENGBU
2011年
10期
1047-1049
,共3页
丁淑琴%章尧%陈昌杰%杨清玲%程龙强
丁淑琴%章堯%陳昌傑%楊清玲%程龍彊
정숙금%장요%진창걸%양청령%정룡강
载脂蛋白M%pGEX-KG%pcDNA3.1(+)%定点诱变
載脂蛋白M%pGEX-KG%pcDNA3.1(+)%定點誘變
재지단백M%pGEX-KG%pcDNA3.1(+)%정점유변
目的:构建人载脂蛋白M(ApoM)野生型和突变型原核表达载体pGEX-KG-ApoM及真核表达载体pcDNA3.1(+)-ApoM.方法:Trizol法抽提HepG2细胞总RNA,RT-PCR扩增 ApoM全长基因,将基因片断重组到PMD18-T 质粒中构建PMD18-T-ApoM重组质粒载体,转化到大肠埃希菌JM109后筛选阳性克隆,提取质粒酶切和测序鉴定.采用Sited-directed Mutagenesis定点诱变试剂盒对ApoM基因进行体外定点诱变,DNA测序鉴定定点诱变成功与否.用双酶切方法分别将ApoM野生型和突变型基因定向连接到原核表达载体pGEX-KG和真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建野生型和突变型pGEX-KG-ApoM重组体和pcDNA3.1(+)-ApoM重组体,分别转化到大肠埃希菌DH5α内,提取质粒酶切鉴定和测序鉴定.结果:成功克隆了ApoM并构建了野生型和突变型原核表达载体和真核表达载体.结论:通过 RT- PCR,定点诱变及基因重组技术成功构建野生型和突变型重组表达质粒pGEX-KG-ApoM和pcDNA3.1(+)-ApoM,为进一步研究ApoM的功能奠定了基础.
目的:構建人載脂蛋白M(ApoM)野生型和突變型原覈錶達載體pGEX-KG-ApoM及真覈錶達載體pcDNA3.1(+)-ApoM.方法:Trizol法抽提HepG2細胞總RNA,RT-PCR擴增 ApoM全長基因,將基因片斷重組到PMD18-T 質粒中構建PMD18-T-ApoM重組質粒載體,轉化到大腸埃希菌JM109後篩選暘性剋隆,提取質粒酶切和測序鑒定.採用Sited-directed Mutagenesis定點誘變試劑盒對ApoM基因進行體外定點誘變,DNA測序鑒定定點誘變成功與否.用雙酶切方法分彆將ApoM野生型和突變型基因定嚮連接到原覈錶達載體pGEX-KG和真覈錶達載體pcDNA3.1(+)中,構建野生型和突變型pGEX-KG-ApoM重組體和pcDNA3.1(+)-ApoM重組體,分彆轉化到大腸埃希菌DH5α內,提取質粒酶切鑒定和測序鑒定.結果:成功剋隆瞭ApoM併構建瞭野生型和突變型原覈錶達載體和真覈錶達載體.結論:通過 RT- PCR,定點誘變及基因重組技術成功構建野生型和突變型重組錶達質粒pGEX-KG-ApoM和pcDNA3.1(+)-ApoM,為進一步研究ApoM的功能奠定瞭基礎.
목적:구건인재지단백M(ApoM)야생형화돌변형원핵표체재체pGEX-KG-ApoM급진핵표체재체pcDNA3.1(+)-ApoM.방법:Trizol법추제HepG2세포총RNA,RT-PCR확증 ApoM전장기인,장기인편단중조도PMD18-T 질립중구건PMD18-T-ApoM중조질립재체,전화도대장애희균JM109후사선양성극륭,제취질립매절화측서감정.채용Sited-directed Mutagenesis정점유변시제합대ApoM기인진행체외정점유변,DNA측서감정정점유변성공여부.용쌍매절방법분별장ApoM야생형화돌변형기인정향련접도원핵표체재체pGEX-KG화진핵표체재체pcDNA3.1(+)중,구건야생형화돌변형pGEX-KG-ApoM중조체화pcDNA3.1(+)-ApoM중조체,분별전화도대장애희균DH5α내,제취질립매절감정화측서감정.결과:성공극륭료ApoM병구건료야생형화돌변형원핵표체재체화진핵표체재체.결론:통과 RT- PCR,정점유변급기인중조기술성공구건야생형화돌변형중조표체질립pGEX-KG-ApoM화pcDNA3.1(+)-ApoM,위진일보연구ApoM적공능전정료기출.
