生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2006年
5期
737-743
,共7页
韦琴%彭贵青%金梅林%朱裕东%周红波%郭红燕%陈焕春
韋琴%彭貴青%金梅林%硃裕東%週紅波%郭紅燕%陳煥春
위금%팽귀청%금매림%주유동%주홍파%곽홍연%진환춘
ChIFN-α基因%抗病毒效果%H9N2禽流感病毒%新城疫病毒揪
ChIFN-α基因%抗病毒效果%H9N2禽流感病毒%新城疫病毒揪
ChIFN-α기인%항병독효과%H9N2금류감병독%신성역병독추
通过PCR从三黄肉鸡的肝脏基因组中扩增了鸡α干扰素(ChIFN-α)全长基因.序列分析表明ChIFN-α基因全长582bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因(489bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET-28a(+)-IFNα,使IFN-α置于pET-28a的T7启动子下游并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合.经酶切鉴定,DNA测序证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE,Western-blot分析证实表达出22kD左右的融合蛋白,表达的蛋白以不溶性的包涵体形式存在并且具有良好的免疫学活性.提纯的包涵体纯度可达70%以上,用镍亲和层析方法纯化蛋白则可达到95%.经透析复性后的蛋白在鸡胚成纤维细胞上能够抑制H9N2禽流感病毒的复制.鸡胚试验中重组干扰素抗病毒效果好:在H9N2禽流感病毒攻毒组中,能保护鸡胚并使其孵出率达到100%的重组干扰素最小蛋白含量为2μg;重组干扰素对新城疫病毒复制也有一定的抑制能力,延迟该病毒复制时间为12h至48h;雏鸡试验表明重组干扰素也能较好地抵抗H9N2禽流感病毒对雏鸡的感染.两组试验均表明,亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20倍左右.
通過PCR從三黃肉鷄的肝髒基因組中擴增瞭鷄α榦擾素(ChIFN-α)全長基因.序列分析錶明ChIFN-α基因全長582bp,亞剋隆其成熟蛋白編碼基因(489bp),利用基因重組技術構建瞭E.coli/pET-28a(+)-IFNα,使IFN-α置于pET-28a的T7啟動子下遊併同6×His(多聚組氨痠標籤)-Tag融閤.經酶切鑒定,DNA測序證實重組質粒構建正確;將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導錶達,SDS-PAGE,Western-blot分析證實錶達齣22kD左右的融閤蛋白,錶達的蛋白以不溶性的包涵體形式存在併且具有良好的免疫學活性.提純的包涵體純度可達70%以上,用鎳親和層析方法純化蛋白則可達到95%.經透析複性後的蛋白在鷄胚成纖維細胞上能夠抑製H9N2禽流感病毒的複製.鷄胚試驗中重組榦擾素抗病毒效果好:在H9N2禽流感病毒攻毒組中,能保護鷄胚併使其孵齣率達到100%的重組榦擾素最小蛋白含量為2μg;重組榦擾素對新城疫病毒複製也有一定的抑製能力,延遲該病毒複製時間為12h至48h;雛鷄試驗錶明重組榦擾素也能較好地牴抗H9N2禽流感病毒對雛鷄的感染.兩組試驗均錶明,親和層析純化蛋白是包涵體蛋白活性的20倍左右.
통과PCR종삼황육계적간장기인조중확증료계α간우소(ChIFN-α)전장기인.서렬분석표명ChIFN-α기인전장582bp,아극륭기성숙단백편마기인(489bp),이용기인중조기술구건료E.coli/pET-28a(+)-IFNα,사IFN-α치우pET-28a적T7계동자하유병동6×His(다취조안산표첨)-Tag융합.경매절감정,DNA측서증실중조질립구건정학;장중조질립전화대장간균BL21(DE3),IPTG유도표체,SDS-PAGE,Western-blot분석증실표체출22kD좌우적융합단백,표체적단백이불용성적포함체형식존재병차구유량호적면역학활성.제순적포함체순도가체70%이상,용얼친화층석방법순화단백칙가체도95%.경투석복성후적단백재계배성섬유세포상능구억제H9N2금류감병독적복제.계배시험중중조간우소항병독효과호:재H9N2금류감병독공독조중,능보호계배병사기부출솔체도100%적중조간우소최소단백함량위2μg;중조간우소대신성역병독복제야유일정적억제능력,연지해병독복제시간위12h지48h;추계시험표명중조간우소야능교호지저항H9N2금류감병독대추계적감염.량조시험균표명,친화층석순화단백시포함체단백활성적20배좌우.