CAJ | 학술논문

目的构建含有CEA启动子(CEA promoter,Cp)启动的双自杀基因CD与TK的复制缺陷型腺病毒.方法设计带有限制性内切酶酶切序列的PCR引物.在2μl T4 DNA ligase作用下,Cp插入pAdTrack(pAT)的MCS,形成pAT.Cp;CD插入pAT.Cp的MCS,形成pAT.Cp.C;TK插入pAT.Cp.C的MCS,形成pAT.Cp.C.T.5 μg pAT.Cp.C.T经4 μl Pme Ⅰ线化后,转化BJ5183-AD-1,1μl PacⅠ酶切鉴定.重组AdEasy质粒转化XL10-Gold细胞,大量扩增提取纯化,转染5 × 105 AD-293细胞,荧光显微镜观察,制备带有Cp.C.T重组腺病毒(recombinant adenovirus with Cp.C.T,RA-Cp.C.T),测定病毒滴度.结果pAT.Cp,pAT.Cp.C,pAT.Cp.C.T双酶切以及PCR均见长约500 bp的Cp,1 300 bp的CD,1 100 bp的TK.对照质粒DNA转化BJ5183-AD-1效率为7.36×106 cfu/μg.线化pAT.Cp.C.T转化BJ5183-AD-1,形成重组AdEasy质粒DNA,Pac Ⅰ酶切见典型长约3.0或4.5kb与30.0kbDNA片断.重组质粒转染AD-293出现绿色荧光.RA-Cp.C.T滴度为5.67×107 pfu/ml.结论RA-Cp.C.T构建正确;AdEasy XL腺病毒载体系统转导Cp.C.T具有高效性,易于观察转染效果.
목적구건함유CEA계동자(CEA promoter,Cp)계동적쌍자살기인CD여TK적복제결함형선병독.방법설계대유한제성내절매매절서렬적PCR인물.재2μl T4 DNA ligase작용하,Cp삽입pAdTrack(pAT)적MCS,형성pAT.Cp;CD삽입pAT.Cp적MCS,형성pAT.Cp.C;TK삽입pAT.Cp.C적MCS,형성pAT.Cp.C.T.5 μg pAT.Cp.C.T경4 μl Pme Ⅰ선화후,전화BJ5183-AD-1,1μl PacⅠ매절감정.중조AdEasy질립전화XL10-Gold세포,대량확증제취순화,전염5 × 105 AD-293세포,형광현미경관찰,제비대유Cp.C.T중조선병독(recombinant adenovirus with Cp.C.T,RA-Cp.C.T),측정병독적도.결과pAT.Cp,pAT.Cp.C,pAT.Cp.C.T쌍매절이급PCR균견장약500 bp적Cp,1 300 bp적CD,1 100 bp적TK.대조질립DNA전화BJ5183-AD-1효솔위7.36×106 cfu/μg.선화pAT.Cp.C.T전화BJ5183-AD-1,형성중조AdEasy질립DNA,Pac Ⅰ매절견전형장약3.0혹4.5kb여30.0kbDNA편단.중조질립전염AD-293출현록색형광.RA-Cp.C.T적도위5.67×107 pfu/ml.결론RA-Cp.C.T구건정학;AdEasy XL선병독재체계통전도Cp.C.T구유고효성,역우관찰전염효과.