CAJ | 학술논문

目的应用噬菌体展示技术构建钠泵抑制物单链抗体库. 方法用OUA-OVA(ouabain-ovalbumin)免疫小鼠,取脾脏,分离淋巴细胞,提取mRNA,逆转录成cDNA第一链,用简并引物经PCR分别扩增轻、重链抗体库,经重叠延伸PCR由Linker将轻、重链拼接成ScFv (单链抗体),用RS引物以ScFv 为模板进行第2次PCR, 同时在5及3端分别加上SfiI, NotI酶切位点. 经SfiI, NotI酶切后, 在T4连接酶的作用下将ScFv与pCANTAB 5E噬菌粒连接,电转化进入TG1大肠杆菌,挑取12个单菌落提取质粒用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切鉴定, 后经M13KO7辅助噬菌体拯救, 离心收集上清即为全套ScFv基因的噬菌体表面展示文库. 结果以OUA-OVA免疫小鼠, 检测血清中抗体效价可达(1∶2×106), 用通用引物分别扩增出轻、重链片段的大小为325 bp和340 bp, 将两者拼接得到约720 bp大小的单链抗体库, 以8×1011的转化效率转染TG1细胞, EcoRⅠ和HindⅢ酶切后,12个单菌落所提噬菌粒DNA中有10个切出了约为2.1 kb的目的条带,所构建的噬菌体抗体库库容量约为1.2×108. 经M13KO7超感染后, 测噬斑滴度为9×1014 pfu*L-1. 结论成功地构建了钠泵抑制物噬菌体单链抗体库.
목적응용서균체전시기술구건납빙억제물단련항체고. 방법용OUA-OVA(ouabain-ovalbumin)면역소서,취비장,분리림파세포,제취mRNA,역전록성cDNA제일련,용간병인물경PCR분별확증경、중련항체고,경중첩연신PCR유Linker장경、중련병접성ScFv (단련항체),용RS인물이ScFv 위모판진행제2차PCR, 동시재5급3단분별가상SfiI, NotI매절위점. 경SfiI, NotI매절후, 재T4련접매적작용하장ScFv여pCANTAB 5E서균립련접,전전화진입TG1대장간균,도취12개단균락제취질립용EcoRⅠ화HindⅢ진행매절감정, 후경M13KO7보조서균체증구, 리심수집상청즉위전투ScFv기인적서균체표면전시문고. 결과이OUA-OVA면역소서, 검측혈청중항체효개가체(1∶2×106), 용통용인물분별확증출경、중련편단적대소위325 bp화340 bp, 장량자병접득도약720 bp대소적단련항체고, 이8×1011적전화효솔전염TG1세포, EcoRⅠ화HindⅢ매절후,12개단균락소제서균립DNA중유10개절출료약위2.1 kb적목적조대,소구건적서균체항체고고용량약위1.2×108. 경M13KO7초감염후, 측서반적도위9×1014 pfu*L-1. 결론성공지구건료납빙억제물서균체단련항체고.