医学研究生学报
醫學研究生學報
의학연구생학보
JOURNAL OF MEDICAL POSTGRADUATE
2011年
2期
139-142
,共4页
张海锋%何红秋%刘斌%杨东%张小轶%谭建军%陈慰祖%王存新
張海鋒%何紅鞦%劉斌%楊東%張小軼%譚建軍%陳慰祖%王存新
장해봉%하홍추%류빈%양동%장소질%담건군%진위조%왕존신
人免疫缺陷病毒%逆转录酶%原核表达%纯化
人免疫缺陷病毒%逆轉錄酶%原覈錶達%純化
인면역결함병독%역전록매%원핵표체%순화
目的 人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)-1逆转录酶是由p66和p51亚单位组成的异二聚体,抑制其活性可阻断HIV-1的复制,是治疗获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的重要靶点.获得大量纯化的HIV-1 p66亚单位蛋白有助于研究其活性,为抗HIV-1药物研究提供药物筛选平台.文中构建HIV-1逆转录酶基因的原核表达系统,获取高纯度高活性的HIV-1 p66亚单位重组蛋白.方法 用PCR从含HIV-1 HXB2标准株全基因的质粒中扩增出编码HIV逆转录酶p66亚单位的基因,通过酶切、连接等方法构建重组质粒pET-28a( + )-p66,并转化到宿主菌大肠埃希菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达.表达产物经镍柱亲和层析纯化后获得HIV逆转录酶p66亚单位蛋白.结果 所构建了pET-28a( + )-p66质粒酶切片段为1680bp,测序符合HIV逆转录酶p66亚单位编码基因序列.在IPTG诱导下表达相对分子质量为66000的HIV逆转录酶p66亚单位蛋白.结论 成功构建了pET-28a( + )-p66质粒,具有较高的HIV逆转录酶p66亚单位蛋白表达效率及活性.
目的 人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)-1逆轉錄酶是由p66和p51亞單位組成的異二聚體,抑製其活性可阻斷HIV-1的複製,是治療穫得性免疫缺陷綜閤徵(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的重要靶點.穫得大量純化的HIV-1 p66亞單位蛋白有助于研究其活性,為抗HIV-1藥物研究提供藥物篩選平檯.文中構建HIV-1逆轉錄酶基因的原覈錶達繫統,穫取高純度高活性的HIV-1 p66亞單位重組蛋白.方法 用PCR從含HIV-1 HXB2標準株全基因的質粒中擴增齣編碼HIV逆轉錄酶p66亞單位的基因,通過酶切、連接等方法構建重組質粒pET-28a( + )-p66,併轉化到宿主菌大腸埃希菌BL21(DE3)中,用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)誘導錶達.錶達產物經鎳柱親和層析純化後穫得HIV逆轉錄酶p66亞單位蛋白.結果 所構建瞭pET-28a( + )-p66質粒酶切片段為1680bp,測序符閤HIV逆轉錄酶p66亞單位編碼基因序列.在IPTG誘導下錶達相對分子質量為66000的HIV逆轉錄酶p66亞單位蛋白.結論 成功構建瞭pET-28a( + )-p66質粒,具有較高的HIV逆轉錄酶p66亞單位蛋白錶達效率及活性.
목적 인면역결함병독(human immunodeficiency virus,HIV)-1역전록매시유p66화p51아단위조성적이이취체,억제기활성가조단HIV-1적복제,시치료획득성면역결함종합정(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)적중요파점.획득대량순화적HIV-1 p66아단위단백유조우연구기활성,위항HIV-1약물연구제공약물사선평태.문중구건HIV-1역전록매기인적원핵표체계통,획취고순도고활성적HIV-1 p66아단위중조단백.방법 용PCR종함HIV-1 HXB2표준주전기인적질립중확증출편마HIV역전록매p66아단위적기인,통과매절、련접등방법구건중조질립pET-28a( + )-p66,병전화도숙주균대장애희균BL21(DE3)중,용이병기-β-D-류대필남반유당감(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)유도표체.표체산물경얼주친화층석순화후획득HIV역전록매p66아단위단백.결과 소구건료pET-28a( + )-p66질립매절편단위1680bp,측서부합HIV역전록매p66아단위편마기인서렬.재IPTG유도하표체상대분자질량위66000적HIV역전록매p66아단위단백.결론 성공구건료pET-28a( + )-p66질립,구유교고적HIV역전록매p66아단위단백표체효솔급활성.
