CAJ | 학술논문

目的:构建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC 155-NT21MP真核表达质粒,利用双分子荧光互补( BiFC)技术,在活细胞内直接观察趋化因子受体4(chemokine receptor 4、CXCR4和CD184)与CXCR4抑制性多肽的相互作用.方法:应用化学合成法获得巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N端21肽(N-terminal 21-mer peptide,NT21MP)编码的基因序列,克隆至经Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pBiFC-VC155中,筛选含有目标基因的正确克隆.利用RT-PCR扩增人乳腺癌细胞株SKBR3的CXCR4全长基因后,T-A亚克隆至经Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pBiFC-VN173载体中.然后,经酶切鉴定及DNA测序分析2个基因是否正确连接至真核表达载体中.应用脂质体转染的方法共转染pBiFC-VC155-NT21 MP和pBiFC-VC155-CXCR4至细胞株COS-7中,在荧光显微镜下观察NT21MP与CXCR4在胞内的相互作用.结果:经DNA测序及同源性对比,证实pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VN173-CXCR4重组栽体构建成功；基因片段与NCBI基因库vMIP-Ⅱ和CXCR4基因CDS序列同源性达99.9％.BiFC法观察NT21MP与CXCR4在细胞内结合出现的荧光信号,该信号分布细胞内.结论:本实验成功构建了应用BiFC技术的真核表达载体,并且在活细胞内检测到NT21MP与CXCR4的互相结合.
목적:구건pBIFC-VN173-CXCR4화pBIFC-VC 155-NT21MP진핵표체질립,이용쌍분자형광호보( BiFC)기술,재활세포내직접관찰추화인자수체4(chemokine receptor 4、CXCR4화CD184)여CXCR4억제성다태적상호작용.방법:응용화학합성법획득거서세포염증단백Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N단21태(N-terminal 21-mer peptide,NT21MP)편마적기인서렬,극륭지경Kpn Ⅰ화EcoR Ⅰ매절적pBiFC-VC155중,사선함유목표기인적정학극륭.이용RT-PCR확증인유선암세포주SKBR3적CXCR4전장기인후,T-A아극륭지경Kpn Ⅰ화EcoR Ⅰ매절적pBiFC-VN173재체중.연후,경매절감정급DNA측서분석2개기인시부정학련접지진핵표체재체중.응용지질체전염적방법공전염pBiFC-VC155-NT21 MP화pBiFC-VC155-CXCR4지세포주COS-7중,재형광현미경하관찰NT21MP여CXCR4재포내적상호작용.결과:경DNA측서급동원성대비,증실pBiFC-VC155-NT21MP화pBiFC-VN173-CXCR4중조재체구건성공；기인편단여NCBI기인고vMIP-Ⅱ화CXCR4기인CDS서렬동원성체99.9％.BiFC법관찰NT21MP여CXCR4재세포내결합출현적형광신호,해신호분포세포내.결론:본실험성공구건료응용BiFC기술적진핵표체재체,병차재활세포내검측도NT21MP여CXCR4적호상결합.