中国组织工程研究与临床康复
中國組織工程研究與臨床康複
중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2008年
7期
1277-1280
,共4页
基因工程%腺病毒%白细胞介素10%组织构建
基因工程%腺病毒%白細胞介素10%組織構建
기인공정%선병독%백세포개소10%조직구건
目的:AdEasy系统可在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组,经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞获得重组病毒,极大简化了载体的构建过程.实验利用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒.方法:实验于2006-08/2007-05在青岛大学医学院病毒学实验室完成.①实验材料:清洁级SD大鼠5只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,骨架质粒pAdeasy-1,大肠杆菌BJ5183和DH10B,人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物教研室罗兵教授惠赠.②实验方法:从脂多糖刺激培养的大鼠脾细胞中提取细胞总RNA,应用反转录多聚酶链反应技术扩增白细胞介素10 cDNA,定向亚克隆至pAdtrack-CMV中构建腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-IL-10,酶切线性化后转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌中,获得重组腺病毒质粒pAd-IL-10,Lipofectamin包装转染293细胞,获得重组腺病毒vAd-IL-10,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.将293细胞接种于96孔板中,每孔1×104个细胞,浓缩后的病毒贮存液按不同比例稀释加至培养板中,测定重组腺病毒滴度.用重组腺病毒vAd-IL-10感染293细胞3 d后,以TRIzol一步法提取细胞总RNA,所获RNA加入DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA后,PCR产物行琼脂糖电泳检测白细胞介素10 mRNA的表达.结果:①重组腺病毒的包装及滴度测定:经限制性内切酶转染293细胞16 h后,荧光显微镜观察到细胞中有GFP荧光,可间接反映目的基因的表达.将病毒上清反复感染293细胞扩增重组腺病毒,通常传至第4～5代于接种病毒后24～48 h,几乎可观察到所有细胞出现荧光,此时收获病毒,重组病毒命名为vAd-IL-10.vAd-IL-10滴度为5.5×108 pfu/mL,vAd-GFP滴度为9.0×108 pfu/mL.②目的基因RT-PCR产物的鉴定:提取重组腺病毒感染293细胞总RNA,RT-PCR扩增后琼脂糖电泳显示特异性580 bp预计大小的片段,表明该重组腺病毒可在293细胞中有效转录.结论:利用AdEasy腺病毒载体系统成功构建了携带白细胞介素10基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度的重组腺病毒vAd-IL-10,可在293细胞中有效转录.
目的:AdEasy繫統可在原覈細胞E.coli BJ5183中完成穿梭質粒與骨架質粒之間的高效同源重組,經抗生素培養闆篩選重組體,然後轉染293細胞穫得重組病毒,極大簡化瞭載體的構建過程.實驗利用AdEasy腺病毒載體繫統構建鼠白細胞介素10基因重組腺病毒.方法:實驗于2006-08/2007-05在青島大學醫學院病毒學實驗室完成.①實驗材料:清潔級SD大鼠5隻,實驗過程中對動物的處置符閤動物倫理學標準.腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV,骨架質粒pAdeasy-1,大腸桿菌BJ5183和DH10B,人胚腎293細胞均由青島大學醫學院微生物教研室囉兵教授惠贈.②實驗方法:從脂多糖刺激培養的大鼠脾細胞中提取細胞總RNA,應用反轉錄多聚酶鏈反應技術擴增白細胞介素10 cDNA,定嚮亞剋隆至pAdtrack-CMV中構建腺病毒穿梭質粒pAdtrack-CMV-IL-10,酶切線性化後轉化到含腺病毒骨架質粒pAdEasy的BJ5183大腸桿菌中,穫得重組腺病毒質粒pAd-IL-10,Lipofectamin包裝轉染293細胞,穫得重組腺病毒vAd-IL-10,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的錶達.將293細胞接種于96孔闆中,每孔1×104箇細胞,濃縮後的病毒貯存液按不同比例稀釋加至培養闆中,測定重組腺病毒滴度.用重組腺病毒vAd-IL-10感染293細胞3 d後,以TRIzol一步法提取細胞總RNA,所穫RNA加入DNaseⅠ消化處理可能汙染的DNA後,PCR產物行瓊脂糖電泳檢測白細胞介素10 mRNA的錶達.結果:①重組腺病毒的包裝及滴度測定:經限製性內切酶轉染293細胞16 h後,熒光顯微鏡觀察到細胞中有GFP熒光,可間接反映目的基因的錶達.將病毒上清反複感染293細胞擴增重組腺病毒,通常傳至第4～5代于接種病毒後24～48 h,幾乎可觀察到所有細胞齣現熒光,此時收穫病毒,重組病毒命名為vAd-IL-10.vAd-IL-10滴度為5.5×108 pfu/mL,vAd-GFP滴度為9.0×108 pfu/mL.②目的基因RT-PCR產物的鑒定:提取重組腺病毒感染293細胞總RNA,RT-PCR擴增後瓊脂糖電泳顯示特異性580 bp預計大小的片段,錶明該重組腺病毒可在293細胞中有效轉錄.結論:利用AdEasy腺病毒載體繫統成功構建瞭攜帶白細胞介素10基因的重組腺病毒載體,併製備齣高滴度的重組腺病毒vAd-IL-10,可在293細胞中有效轉錄.
목적:AdEasy계통가재원핵세포E.coli BJ5183중완성천사질립여골가질립지간적고효동원중조,경항생소배양판사선중조체,연후전염293세포획득중조병독,겁대간화료재체적구건과정.실험이용AdEasy선병독재체계통구건서백세포개소10기인중조선병독.방법:실험우2006-08/2007-05재청도대학의학원병독학실험실완성.①실험재료:청길급SD대서5지,실험과정중대동물적처치부합동물윤리학표준.선병독천사질립pAdTrack-CMV,골가질립pAdeasy-1,대장간균BJ5183화DH10B,인배신293세포균유청도대학의학원미생물교연실라병교수혜증.②실험방법:종지다당자격배양적대서비세포중제취세포총RNA,응용반전록다취매련반응기술확증백세포개소10 cDNA,정향아극륭지pAdtrack-CMV중구건선병독천사질립pAdtrack-CMV-IL-10,매절선성화후전화도함선병독골가질립pAdEasy적BJ5183대장간균중,획득중조선병독질립pAd-IL-10,Lipofectamin포장전염293세포,획득중조선병독vAd-IL-10,형광현미경하관찰록색형광단백적표체.장293세포접충우96공판중,매공1×104개세포,농축후적병독저존액안불동비례희석가지배양판중,측정중조선병독적도.용중조선병독vAd-IL-10감염293세포3 d후,이TRIzol일보법제취세포총RNA,소획RNA가입DNaseⅠ소화처리가능오염적DNA후,PCR산물행경지당전영검측백세포개소10 mRNA적표체.결과:①중조선병독적포장급적도측정:경한제성내절매전염293세포16 h후,형광현미경관찰도세포중유GFP형광,가간접반영목적기인적표체.장병독상청반복감염293세포확증중조선병독,통상전지제4～5대우접충병독후24～48 h,궤호가관찰도소유세포출현형광,차시수획병독,중조병독명명위vAd-IL-10.vAd-IL-10적도위5.5×108 pfu/mL,vAd-GFP적도위9.0×108 pfu/mL.②목적기인RT-PCR산물적감정:제취중조선병독감염293세포총RNA,RT-PCR확증후경지당전영현시특이성580 bp예계대소적편단,표명해중조선병독가재293세포중유효전록.결론:이용AdEasy선병독재체계통성공구건료휴대백세포개소10기인적중조선병독재체,병제비출고적도적중조선병독vAd-IL-10,가재293세포중유효전록.
