生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2004年
6期
906-911
,共6页
冯美卿%蔡钦生%宋大新%钟江%吴满平%周珮
馮美卿%蔡欽生%宋大新%鐘江%吳滿平%週珮
풍미경%채흠생%송대신%종강%오만평%주패
重组人载酯蛋白ApoAⅠ%毕赤酵母%表达优化
重組人載酯蛋白ApoAⅠ%畢赤酵母%錶達優化
중조인재지단백ApoAⅠ%필적효모%표체우화
高密度脂蛋白(High-density Lipoprotein,HDL)是血浆中重要的脂蛋白,其主要成分为载脂蛋白A Ⅰ(Apoliprotein AⅠ,ApoAⅠ为了大量制备该蛋白,首先尝试利用Pichia pastoris表达系统高效表达ApoAⅠ.通过PCR扩增获得天然含人载脂蛋白ApoAⅠ的基因片段,将其插入到P.pastoris分泌型载体pPIC9K上,BglⅡ酶切线性化后电转化P.pastoris GS115,将获得的1000多个转化子依次在含不同G418浓度的YPD平板筛选高抗性转化子,得到的22个高抗性转化子经甲醇诱导,SDS-PAGE检测得到6株高表达菌.然后对其中的高表达菌株AP16的培养及诱导条件进行了优化,结果显示:接种后培养24～28h,转入诱导阶段,培养基pH值在7～7.5,菌体密度OD600=80左右,以1%甲醇诱导96h最有利于ApoAⅠ的表达,表达水平达160mg/L.14L发酵罐结果显示表达水平与摇瓶相当,均高于其它表达系统,为大批量制备奠定了基础.
高密度脂蛋白(High-density Lipoprotein,HDL)是血漿中重要的脂蛋白,其主要成分為載脂蛋白A Ⅰ(Apoliprotein AⅠ,ApoAⅠ為瞭大量製備該蛋白,首先嘗試利用Pichia pastoris錶達繫統高效錶達ApoAⅠ.通過PCR擴增穫得天然含人載脂蛋白ApoAⅠ的基因片段,將其插入到P.pastoris分泌型載體pPIC9K上,BglⅡ酶切線性化後電轉化P.pastoris GS115,將穫得的1000多箇轉化子依次在含不同G418濃度的YPD平闆篩選高抗性轉化子,得到的22箇高抗性轉化子經甲醇誘導,SDS-PAGE檢測得到6株高錶達菌.然後對其中的高錶達菌株AP16的培養及誘導條件進行瞭優化,結果顯示:接種後培養24～28h,轉入誘導階段,培養基pH值在7～7.5,菌體密度OD600=80左右,以1%甲醇誘導96h最有利于ApoAⅠ的錶達,錶達水平達160mg/L.14L髮酵罐結果顯示錶達水平與搖瓶相噹,均高于其它錶達繫統,為大批量製備奠定瞭基礎.
고밀도지단백(High-density Lipoprotein,HDL)시혈장중중요적지단백,기주요성분위재지단백A Ⅰ(Apoliprotein AⅠ,ApoAⅠ위료대량제비해단백,수선상시이용Pichia pastoris표체계통고효표체ApoAⅠ.통과PCR확증획득천연함인재지단백ApoAⅠ적기인편단,장기삽입도P.pastoris분비형재체pPIC9K상,BglⅡ매절선성화후전전화P.pastoris GS115,장획득적1000다개전화자의차재함불동G418농도적YPD평판사선고항성전화자,득도적22개고항성전화자경갑순유도,SDS-PAGE검측득도6주고표체균.연후대기중적고표체균주AP16적배양급유도조건진행료우화,결과현시:접충후배양24～28h,전입유도계단,배양기pH치재7～7.5,균체밀도OD600=80좌우,이1%갑순유도96h최유리우ApoAⅠ적표체,표체수평체160mg/L.14L발효관결과현시표체수평여요병상당,균고우기타표체계통,위대비량제비전정료기출.
