CAJ | 학술논문

目的:建立精原干细胞与骨髓基质细胞共培养细胞模型,探讨骨髓基质细胞层支持精原干细胞扩增的可能机制.方法:实验于2004-03/2005-04在泸州医学院医学分子生物学实验室完成.以6～8 d龄小鼠为材料,脱颈处死后经体积分数为0.75的乙醇浸泡消毒,打开腹腔分离双侧睾丸,采用0.25%胰酶消化离心后培养睾丸细胞,采用差速贴壁法分离支持细胞与生精细胞.同时取小鼠胫骨骨髓,分离后用IMDM培养基培养,待细胞生长至单层时,以10 mg/L丝裂霉素C处理的原代培养骨髓基质细胞作为饲养层,并将分离后的生精细胞接种至饲养层上,以含体积分数为0.1的小牛血清的IMDM为培养基,37℃下共培养,在倒置相差显微镜下观察细胞的生长特点,并对培养15 d的细胞进行苏木精-伊红染色、碱性磷酸酶染色及C-Kit受体检测.结果:①支持细胞在培养后4～6 h就开始贴附变形,此时生精细胞仍呈圆形,且悬浮于培养基中,将悬浮的圆形生精细胞吸出后接种于骨髓基质饲养层上共培养.培养8 h后,见体积较小的原形细胞开始贴附增殖,继续培养三四天后见体积相对较大的圆形细胞开始死亡,推测增殖较小的细胞为精原干细胞.增殖细胞的生长特点及形态学特征与文献报道精原干细胞的特征相符合.②苏木精-伊红染色显示培养的生殖细胞大小均匀,核大而圆着色深、胞质浅染、核质比高;碱性磷酸酶染色见胞质和细胞膜为阳性,C-Kit受体显示细胞膜呈强阳性,背景基质细胞为阴性.这些均符合精原干细胞的生物学特征.结论:精原干细胞在未加入细胞因子、原代培养的骨髓基质细胞饲养层中能较长时间生长并分裂增殖,推测骨髓基质细胞通过分泌生物活性物质和细胞黏附分子支持精原干细胞的扩增.
목적:건립정원간세포여골수기질세포공배양세포모형,탐토골수기질세포층지지정원간세포확증적가능궤제.방법:실험우2004-03/2005-04재로주의학원의학분자생물학실험실완성.이6～8 d령소서위재료,탈경처사후경체적분수위0.75적을순침포소독,타개복강분리쌍측고환,채용0.25%이매소화리심후배양고환세포,채용차속첩벽법분리지지세포여생정세포.동시취소서경골골수,분리후용IMDM배양기배양,대세포생장지단층시,이10 mg/L사렬매소C처리적원대배양골수기질세포작위사양층,병장분리후적생정세포접충지사양층상,이함체적분수위0.1적소우혈청적IMDM위배양기,37℃하공배양,재도치상차현미경하관찰세포적생장특점,병대배양15 d적세포진행소목정-이홍염색、감성린산매염색급C-Kit수체검측.결과:①지지세포재배양후4～6 h취개시첩부변형,차시생정세포잉정원형,차현부우배양기중,장현부적원형생정세포흡출후접충우골수기질사양층상공배양.배양8 h후,견체적교소적원형세포개시첩부증식,계속배양삼사천후견체적상대교대적원형세포개시사망,추측증식교소적세포위정원간세포.증식세포적생장특점급형태학특정여문헌보도정원간세포적특정상부합.②소목정-이홍염색현시배양적생식세포대소균균,핵대이원착색심、포질천염、핵질비고;감성린산매염색견포질화세포막위양성,C-Kit수체현시세포막정강양성,배경기질세포위음성.저사균부합정원간세포적생물학특정.결론:정원간세포재미가입세포인자、원대배양적골수기질세포사양층중능교장시간생장병분렬증식,추측골수기질세포통과분비생물활성물질화세포점부분자지지정원간세포적확증.