微生物学报
微生物學報
미생물학보
ACTA MICROBIOLOGICA SINICA
2003年
1期
56-64
,共9页
卢捷%姚玉峰%姜卫红%焦瑞身
盧捷%姚玉峰%薑衛紅%焦瑞身
로첩%요옥봉%강위홍%초서신
地中海拟无枝菌酸菌%乙酰辅酶A羧化酶%生物素羧基载体蛋白%转录调节
地中海擬無枝菌痠菌%乙酰輔酶A羧化酶%生物素羧基載體蛋白%轉錄調節
지중해의무지균산균%을선보매A최화매%생물소최기재체단백%전록조절
乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA Carboxylase EC 6.4.1.2, ACC)催化依赖于ATP的乙酰辅酶A羧化形成丙二酸单酰辅酶A,该反应是脂肪酸生物合成途径中的第一步,也是受到调控的关键一步.根据结核分枝杆菌(M. tuberculosis)和天蓝色链霉菌(S. coelicolor)中ACC-α亚基的氨基酸保守序列和地中海拟无枝菌酸菌U32对氨基酸密码子的使用偏好,设计简并引物以U32基因组DNA为模板扩增出一条约250bp的片段,并以此片段作探针成功地从U32基因组cosmid文库中克隆到相应的ACC-α亚基的编码基因accA.该基因对应的ORF长1797bp,编码一个598个氨基酸的蛋白,推算出的分子量是63,714Da;基因G+C mol%含量为70.1%,符合U32基因结构特征,距起始密码子GTG上游6个碱基处有链霉菌典型的RBS序列AGGAGG,并有生物素羧化酶特征的ATP结合区.利用pET28(b)系统构建表达载体,在E. coli BL21(DE3)中实现了accA的诱导表达,产物大部分以可溶形式存在,并通过Western Blot证明该蛋白上确有共价结合的生物素.Northern Blot分析了各种氮源对accA基因转录水平的不同影响.
乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoA Carboxylase EC 6.4.1.2, ACC)催化依賴于ATP的乙酰輔酶A羧化形成丙二痠單酰輔酶A,該反應是脂肪痠生物閤成途徑中的第一步,也是受到調控的關鍵一步.根據結覈分枝桿菌(M. tuberculosis)和天藍色鏈黴菌(S. coelicolor)中ACC-α亞基的氨基痠保守序列和地中海擬無枝菌痠菌U32對氨基痠密碼子的使用偏好,設計簡併引物以U32基因組DNA為模闆擴增齣一條約250bp的片段,併以此片段作探針成功地從U32基因組cosmid文庫中剋隆到相應的ACC-α亞基的編碼基因accA.該基因對應的ORF長1797bp,編碼一箇598箇氨基痠的蛋白,推算齣的分子量是63,714Da;基因G+C mol%含量為70.1%,符閤U32基因結構特徵,距起始密碼子GTG上遊6箇堿基處有鏈黴菌典型的RBS序列AGGAGG,併有生物素羧化酶特徵的ATP結閤區.利用pET28(b)繫統構建錶達載體,在E. coli BL21(DE3)中實現瞭accA的誘導錶達,產物大部分以可溶形式存在,併通過Western Blot證明該蛋白上確有共價結閤的生物素.Northern Blot分析瞭各種氮源對accA基因轉錄水平的不同影響.
을선보매A최화매(Acetyl CoA Carboxylase EC 6.4.1.2, ACC)최화의뢰우ATP적을선보매A최화형성병이산단선보매A,해반응시지방산생물합성도경중적제일보,야시수도조공적관건일보.근거결핵분지간균(M. tuberculosis)화천람색련매균(S. coelicolor)중ACC-α아기적안기산보수서렬화지중해의무지균산균U32대안기산밀마자적사용편호,설계간병인물이U32기인조DNA위모판확증출일조약250bp적편단,병이차편단작탐침성공지종U32기인조cosmid문고중극륭도상응적ACC-α아기적편마기인accA.해기인대응적ORF장1797bp,편마일개598개안기산적단백,추산출적분자량시63,714Da;기인G+C mol%함량위70.1%,부합U32기인결구특정,거기시밀마자GTG상유6개감기처유련매균전형적RBS서렬AGGAGG,병유생물소최화매특정적ATP결합구.이용pET28(b)계통구건표체재체,재E. coli BL21(DE3)중실현료accA적유도표체,산물대부분이가용형식존재,병통과Western Blot증명해단백상학유공개결합적생물소.Northern Blot분석료각충담원대accA기인전록수평적불동영향.
