畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2007年
5期
506-512
,共7页
姚清侠%曹毅%钱平%徐卓菲%何雁南%司有辉%陈焕春
姚清俠%曹毅%錢平%徐卓菲%何雁南%司有輝%陳煥春
요청협%조의%전평%서탁비%하안남%사유휘%진환춘
猪β-干扰素%毕赤酵母%分泌表达%抗病毒活性%口蹄疫病毒
豬β-榦擾素%畢赤酵母%分泌錶達%抗病毒活性%口蹄疫病毒
저β-간우소%필적효모%분비표체%항병독활성%구제역병독
为了高效表达分泌型的猪β-干扰素,将去除信号肽的编码梅山猪β-干扰素成熟多肽基因(mPoIFNβ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC9K,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNβ.将以SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFNβ用化学方法(LiCl),与鲑鱼精DNA(ssDNA)共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后获得阳性菌株,再经高浓度G418筛选到多拷贝菌株.以1%甲醇连续诱导4 d,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明:表达产物为22 ku和26 ku的混合物,在GS115中的表达量约为80 mg/L,占分泌型总蛋白的29.4%～30.8%,表明猪β-干扰素基因在毕赤酵母中获得了高效分泌表达.对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性的抗猪β-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应.以细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素抗病毒活性,在MDBK(牛肾细胞系)中表达的猪β-干扰素的抗VSV比活性达到2.0×106 U/mg;对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用.
為瞭高效錶達分泌型的豬β-榦擾素,將去除信號肽的編碼梅山豬β-榦擾素成熟多肽基因(mPoIFNβ)插入酵母-大腸桿菌穿梭載體pPIC9K,構建成分泌型重組錶達載體pPIC9K-mPoIFNβ.將以SalⅠ線性化的pPIC9K-mPoIFNβ用化學方法(LiCl),與鮭魚精DNA(ssDNA)共轉化入畢赤酵母菌株GS115,轉化子經MD平闆篩選和PCR鑒定後穫得暘性菌株,再經高濃度G418篩選到多拷貝菌株.以1%甲醇連續誘導4 d,SDS-PAGE和Western blot檢測結果錶明:錶達產物為22 ku和26 ku的混閤物,在GS115中的錶達量約為80 mg/L,佔分泌型總蛋白的29.4%～30.8%,錶明豬β-榦擾素基因在畢赤酵母中穫得瞭高效分泌錶達.對錶達產物進行理化分析髮現,重組酵母菌錶達的蛋白耐痠(pH2),對熱(56℃)部分敏感,併能被特異性的抗豬β-榦擾素抗體中和而不與抗豬γ-榦擾素抗體反應.以細胞病變抑製法(CPE50)測定榦擾素抗病毒活性,在MDBK(牛腎細胞繫)中錶達的豬β-榦擾素的抗VSV比活性達到2.0×106 U/mg;對口蹄疫病毒在IBRS-2細胞中的增殖也有明顯的抑製作用.
위료고효표체분비형적저β-간우소,장거제신호태적편마매산저β-간우소성숙다태기인(mPoIFNβ)삽입효모-대장간균천사재체pPIC9K,구건성분비형중조표체재체pPIC9K-mPoIFNβ.장이SalⅠ선성화적pPIC9K-mPoIFNβ용화학방법(LiCl),여해어정DNA(ssDNA)공전화입필적효모균주GS115,전화자경MD평판사선화PCR감정후획득양성균주,재경고농도G418사선도다고패균주.이1%갑순련속유도4 d,SDS-PAGE화Western blot검측결과표명:표체산물위22 ku화26 ku적혼합물,재GS115중적표체량약위80 mg/L,점분비형총단백적29.4%～30.8%,표명저β-간우소기인재필적효모중획득료고효분비표체.대표체산물진행이화분석발현,중조효모균표체적단백내산(pH2),대열(56℃)부분민감,병능피특이성적항저β-간우소항체중화이불여항저γ-간우소항체반응.이세포병변억제법(CPE50)측정간우소항병독활성,재MDBK(우신세포계)중표체적저β-간우소적항VSV비활성체도2.0×106 U/mg;대구제역병독재IBRS-2세포중적증식야유명현적억제작용.
