江苏农业学报
江囌農業學報
강소농업학보
JIANGSU JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES
2011年
6期
1367-1370
,共4页
罗宝正%王振全%薄清如%徐海聂%沙才华%廖秀云%陈伟生
囉寶正%王振全%薄清如%徐海聶%沙纔華%廖秀雲%陳偉生
라보정%왕진전%박청여%서해섭%사재화%료수운%진위생
副猪嗜血杆菌%荧光PCR%检测
副豬嗜血桿菌%熒光PCR%檢測
부저기혈간균%형광PCR%검측
为了建立基于TaqMan探针荧光PCR技术检测副猪嗜血杆菌的方法,本试验参考GenBank已发表的副猪嗜血杆菌(Hemophilus parasuis,HPS)转录起始因子infB基因序列,利用生物学软件Primer Express 2.0设计特异性引物和探针；并对副猪嗜血杆菌标准菌株提取DNA后进行PCR扩增,将产物测序鉴定后克隆到pMD1s-T载体,再转化到大肠杆菌感受态细胞,细菌培养后对菌液进行PCR扩增,把产物测序鉴定后获得的重组质粒作为标准阳性对照；最后将建立的TaqMan探针荧光PCR方法进行灵敏度、特异性、稳定性试验.结果显示,该检测方法可以达到1μl1.0×101拷贝数量级的灵敏度；另外,该方法可以将HPS和大肠杆菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌分开,特异性良好；稳定性试验显示,2次批内变异系数分别为0.65％和0.92％,批间变异系数为1.31％,稳定性良好.对口岸送检的56份猪肉和12份血浆蛋白粉样品进行检测,结果表明TaqMan探针荧光PCR方法和细菌分离方法的检测效果一致.
為瞭建立基于TaqMan探針熒光PCR技術檢測副豬嗜血桿菌的方法,本試驗參攷GenBank已髮錶的副豬嗜血桿菌(Hemophilus parasuis,HPS)轉錄起始因子infB基因序列,利用生物學軟件Primer Express 2.0設計特異性引物和探針；併對副豬嗜血桿菌標準菌株提取DNA後進行PCR擴增,將產物測序鑒定後剋隆到pMD1s-T載體,再轉化到大腸桿菌感受態細胞,細菌培養後對菌液進行PCR擴增,把產物測序鑒定後穫得的重組質粒作為標準暘性對照；最後將建立的TaqMan探針熒光PCR方法進行靈敏度、特異性、穩定性試驗.結果顯示,該檢測方法可以達到1μl1.0×101拷貝數量級的靈敏度；另外,該方法可以將HPS和大腸桿菌O157、沙門氏菌、金黃色葡萄毬菌、豬鏈毬菌分開,特異性良好；穩定性試驗顯示,2次批內變異繫數分彆為0.65％和0.92％,批間變異繫數為1.31％,穩定性良好.對口岸送檢的56份豬肉和12份血漿蛋白粉樣品進行檢測,結果錶明TaqMan探針熒光PCR方法和細菌分離方法的檢測效果一緻.
위료건립기우TaqMan탐침형광PCR기술검측부저기혈간균적방법,본시험삼고GenBank이발표적부저기혈간균(Hemophilus parasuis,HPS)전록기시인자infB기인서렬,이용생물학연건Primer Express 2.0설계특이성인물화탐침；병대부저기혈간균표준균주제취DNA후진행PCR확증,장산물측서감정후극륭도pMD1s-T재체,재전화도대장간균감수태세포,세균배양후대균액진행PCR확증,파산물측서감정후획득적중조질립작위표준양성대조；최후장건립적TaqMan탐침형광PCR방법진행령민도、특이성、은정성시험.결과현시,해검측방법가이체도1μl1.0×101고패수량급적령민도；령외,해방법가이장HPS화대장간균O157、사문씨균、금황색포도구균、저련구균분개,특이성량호；은정성시험현시,2차비내변이계수분별위0.65％화0.92％,비간변이계수위1.31％,은정성량호.대구안송검적56빈저육화12빈혈장단백분양품진행검측,결과표명TaqMan탐침형광PCR방법화세균분리방법적검측효과일치.
