中国组织工程研究与临床康复
中國組織工程研究與臨床康複
중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2008年
21期
4044-4048
,共5页
旷文勇%周新伏%张广森%刘利华%陈绍芳%符桑%唐铁钢%李佳元
曠文勇%週新伏%張廣森%劉利華%陳紹芳%符桑%唐鐵鋼%李佳元
광문용%주신복%장엄삼%류리화%진소방%부상%당철강%리가원
骨髓间充质干细胞%脐带血清%细胞培养%定向分化
骨髓間充質榦細胞%臍帶血清%細胞培養%定嚮分化
골수간충질간세포%제대혈청%세포배양%정향분화
背景:骨髓内的间充质干细胞含量极少,因此课题立项设计之一即如何得到足够数量的骨髓间充质干细胞,并避免细胞培养过程中因动物血清造成的病原体污染和异种血清所致的过敏反应.目的:拟建立脐带血血清培养系统,以实现体外扩增人骨髓间充质干细胞的目标.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-09/2007-10在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成.材料:12份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供,6例采自正常供者,6例采自拟行造血干细胞移植的肿瘤患者.方法:无菌条件下抽取未抗凝的脐带血,静置待血凝块完全析出后吸取血清,离心弃沉淀,取各项病原微生物检测均呈阴性的脐带血血清用于细胞培养,临用前56℃水浴灭活30min.抽取正常供者和肿瘤患者的骨髓液100mL/份,采用Ficoll Paque分离液分离骨髓单个核细胞,加入含体积分数为0.1脐带血血清的DMEM/F12进行传代培养.传至第3代低温、液氮冻存,4～8周后予以解冻复苏,胰蛋白酶消化传代.取第4代骨髓间充质干细胞,锥虫蓝染色后,加入成骨诱导体系培养14d,碱性磷酸酶染色;加入脂肪诱导体系培养14d,油红O染色.主要观察指标:绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及表面抗原的表达,骨髓间充质干细胞定向分化情况.结果:骨髓间充质干细胞扩增培养至第4代,接种后两三天为生长潜伏期,3～5d为对数增殖期,5～7d细胞生长缓慢进入平台期.采自正常供者和肿瘤患者的骨髓间充质干细胞,冻存前后扩增数量均基本相似(P0.05),细胞存活率均96%,CD29、CD73、CDl05阳性率均90%,CD31、CD34、CD45阳性率均5%,诱导2周后成骨细胞和脂肪细胞的阳性率均85%.结论:应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人骨髓间充质干细胞,且冻存前后骨髓间充质干细胞生物学特性没有明显改变.
揹景:骨髓內的間充質榦細胞含量極少,因此課題立項設計之一即如何得到足夠數量的骨髓間充質榦細胞,併避免細胞培養過程中因動物血清造成的病原體汙染和異種血清所緻的過敏反應.目的:擬建立臍帶血血清培養繫統,以實現體外擴增人骨髓間充質榦細胞的目標.設計、時間及地點:開放性實驗,于2006-09/2007-10在中南大學湘雅二醫院細胞生物實驗室完成.材料:12份骨髓標本由中南大學湘雅二醫院和湖南省湘潭市中心醫院提供,6例採自正常供者,6例採自擬行造血榦細胞移植的腫瘤患者.方法:無菌條件下抽取未抗凝的臍帶血,靜置待血凝塊完全析齣後吸取血清,離心棄沉澱,取各項病原微生物檢測均呈陰性的臍帶血血清用于細胞培養,臨用前56℃水浴滅活30min.抽取正常供者和腫瘤患者的骨髓液100mL/份,採用Ficoll Paque分離液分離骨髓單箇覈細胞,加入含體積分數為0.1臍帶血血清的DMEM/F12進行傳代培養.傳至第3代低溫、液氮凍存,4～8週後予以解凍複囌,胰蛋白酶消化傳代.取第4代骨髓間充質榦細胞,錐蟲藍染色後,加入成骨誘導體繫培養14d,堿性燐痠酶染色;加入脂肪誘導體繫培養14d,油紅O染色.主要觀察指標:繪製細胞生長麯線,流式細胞儀測定細胞週期及錶麵抗原的錶達,骨髓間充質榦細胞定嚮分化情況.結果:骨髓間充質榦細胞擴增培養至第4代,接種後兩三天為生長潛伏期,3～5d為對數增殖期,5～7d細胞生長緩慢進入平檯期.採自正常供者和腫瘤患者的骨髓間充質榦細胞,凍存前後擴增數量均基本相似(P0.05),細胞存活率均96%,CD29、CD73、CDl05暘性率均90%,CD31、CD34、CD45暘性率均5%,誘導2週後成骨細胞和脂肪細胞的暘性率均85%.結論:應用滅活臍帶血清培養體繫可成功擴增人骨髓間充質榦細胞,且凍存前後骨髓間充質榦細胞生物學特性沒有明顯改變.
배경:골수내적간충질간세포함량겁소,인차과제립항설계지일즉여하득도족구수량적골수간충질간세포,병피면세포배양과정중인동물혈청조성적병원체오염화이충혈청소치적과민반응.목적:의건립제대혈혈청배양계통,이실현체외확증인골수간충질간세포적목표.설계、시간급지점:개방성실험,우2006-09/2007-10재중남대학상아이의원세포생물실험실완성.재료:12빈골수표본유중남대학상아이의원화호남성상담시중심의원제공,6례채자정상공자,6례채자의행조혈간세포이식적종류환자.방법:무균조건하추취미항응적제대혈,정치대혈응괴완전석출후흡취혈청,리심기침정,취각항병원미생물검측균정음성적제대혈혈청용우세포배양,림용전56℃수욕멸활30min.추취정상공자화종류환자적골수액100mL/빈,채용Ficoll Paque분리액분리골수단개핵세포,가입함체적분수위0.1제대혈혈청적DMEM/F12진행전대배양.전지제3대저온、액담동존,4～8주후여이해동복소,이단백매소화전대.취제4대골수간충질간세포,추충람염색후,가입성골유도체계배양14d,감성린산매염색;가입지방유도체계배양14d,유홍O염색.주요관찰지표:회제세포생장곡선,류식세포의측정세포주기급표면항원적표체,골수간충질간세포정향분화정황.결과:골수간충질간세포확증배양지제4대,접충후량삼천위생장잠복기,3～5d위대수증식기,5～7d세포생장완만진입평태기.채자정상공자화종류환자적골수간충질간세포,동존전후확증수량균기본상사(P0.05),세포존활솔균96%,CD29、CD73、CDl05양성솔균90%,CD31、CD34、CD45양성솔균5%,유도2주후성골세포화지방세포적양성솔균85%.결론:응용멸활제대혈청배양체계가성공확증인골수간충질간세포,차동존전후골수간충질간세포생물학특성몰유명현개변.
