CAJ | 학술논문

目的:利用载体pQE30在大肠埃希菌(M15)原核表达人T-bet基因全长序列,并对表达产物进行纯化、免疫动物和制备多克隆抗体.方法:利用PCR技术从克隆载体pGEM-T/T-bet获得人T-bet的全长编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体pQE30,形成重组表达质粒pT-bet;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌JM109,测序鉴定后转化M15,经IPTG 37℃诱导4 h后,SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色判断以包涵体形式存在的带有6×His标签的融合蛋白(表达产物),用Ni2+-IMAC层析柱对融合蛋白进行纯化;将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备人T-bet的多克隆抗体.结果:成功表达和纯化了人T-bet,并制备了多克隆抗体,ELISA和Western blot结果显示了血清抗体的高效价(1:100 000)和高度特异性.结论:成功构建了原核表达载体pT-bet,并在工程菌M15中获得大量表达,经纯化后获得高纯度的人T-bet蛋白,制备了效价和特异性良好的多克隆抗体,为进一步研究T-bet的生物学功能奠定了的基础.
목적:이용재체pQE30재대장애희균(M15)원핵표체인T-bet기인전장서렬,병대표체산물진행순화、면역동물화제비다극륭항체.방법:이용PCR기술종극륭재체pGEM-T/T-bet획득인T-bet적전장편마서렬,병장기아극륭지원핵표체재체pQE30,형성중조표체질립pT-bet;매절감정도선양성중조질립전화대장애희균JM109,측서감정후전화M15,경IPTG 37℃유도4 h후,SDS-PAGE전영、고마사량람염색판단이포함체형식존재적대유6×His표첨적융합단백(표체산물),용Ni2+-IMAC층석주대융합단백진행순화;장순화적단백면역BALB/c소서,제비인T-bet적다극륭항체.결과:성공표체화순화료인T-bet,병제비료다극륭항체,ELISA화Western blot결과현시료혈청항체적고효개(1:100 000)화고도특이성.결론:성공구건료원핵표체재체pT-bet,병재공정균M15중획득대량표체,경순화후획득고순도적인T-bet단백,제비료효개화특이성량호적다극륭항체,위진일보연구T-bet적생물학공능전정료적기출.