生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2004年
2期
170-174
,共5页
戴五星%陈智浩%高红%黄海浪%梁靓%程继忠%皇甫永穆
戴五星%陳智浩%高紅%黃海浪%樑靚%程繼忠%皇甫永穆
대오성%진지호%고홍%황해랑%량정%정계충%황보영목
信号肽%结核杆菌HSP65%分泌型原核穿梭表达质粒%重组耻垢分枝杆菌
信號肽%結覈桿菌HSP65%分泌型原覈穿梭錶達質粒%重組恥垢分枝桿菌
신호태%결핵간균HSP65%분비형원핵천사표체질립%중조치구분지간균
用PCR技术从Bacillus Calmette-guérin(BCG)基因组中扩增出抗原85B(Ag85B)的信号肽(SP)DNA序列,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因.利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG-2100的人结核杆菌HSP70启动子下游,构建成分泌型原核穿梭表达质粒(pBCG-SP-HSP65).酶切鉴定、PCR和测序分析结果均表明分泌型原核穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65构建成功.利用电穿孔将该质粒转入耻垢分枝杆菌(Mycobacterial smegmatis, MS)中,用卡那霉素筛选出阳性重组子.经热诱导后用SDS-PAGE观察到在耻垢分枝杆菌中65kD蛋白占总蛋白的20%,而在重组耻垢分枝杆菌表达的65kD蛋白占菌体总蛋白的34.46%,占裂解物上清总蛋白的68.56%,表明重组的HSP65基因能在耻垢分枝杆菌中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶状态存在.通过Western-blot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合,说明该重组蛋白具有HSP65的生物学活性.
用PCR技術從Bacillus Calmette-guérin(BCG)基因組中擴增齣抗原85B(Ag85B)的信號肽(SP)DNA序列,從pCMVMTHSP65質粒中擴增齣人結覈桿菌HSP65全長基因.利用DNA重組技術將以上兩箇片段插入質粒pBCG-2100的人結覈桿菌HSP70啟動子下遊,構建成分泌型原覈穿梭錶達質粒(pBCG-SP-HSP65).酶切鑒定、PCR和測序分析結果均錶明分泌型原覈穿梭錶達質粒pBCG-SP-HSP65構建成功.利用電穿孔將該質粒轉入恥垢分枝桿菌(Mycobacterial smegmatis, MS)中,用卡那黴素篩選齣暘性重組子.經熱誘導後用SDS-PAGE觀察到在恥垢分枝桿菌中65kD蛋白佔總蛋白的20%,而在重組恥垢分枝桿菌錶達的65kD蛋白佔菌體總蛋白的34.46%,佔裂解物上清總蛋白的68.56%,錶明重組的HSP65基因能在恥垢分枝桿菌中高效錶達,錶達的蛋白大部分以可溶狀態存在.通過Western-blot證實分泌的該蛋白能與結覈桿菌HSP65的抗體特異性結閤,說明該重組蛋白具有HSP65的生物學活性.
용PCR기술종Bacillus Calmette-guérin(BCG)기인조중확증출항원85B(Ag85B)적신호태(SP)DNA서렬,종pCMVMTHSP65질립중확증출인결핵간균HSP65전장기인.이용DNA중조기술장이상량개편단삽입질립pBCG-2100적인결핵간균HSP70계동자하유,구건성분비형원핵천사표체질립(pBCG-SP-HSP65).매절감정、PCR화측서분석결과균표명분비형원핵천사표체질립pBCG-SP-HSP65구건성공.이용전천공장해질립전입치구분지간균(Mycobacterial smegmatis, MS)중,용잡나매소사선출양성중조자.경열유도후용SDS-PAGE관찰도재치구분지간균중65kD단백점총단백적20%,이재중조치구분지간균표체적65kD단백점균체총단백적34.46%,점렬해물상청총단백적68.56%,표명중조적HSP65기인능재치구분지간균중고효표체,표체적단백대부분이가용상태존재.통과Western-blot증실분비적해단백능여결핵간균HSP65적항체특이성결합,설명해중조단백구유HSP65적생물학활성.
