中国全科医学
中國全科醫學
중국전과의학
CHINESE GENERAL PRACTICE
2009年
16期
1486-1488
,共3页
陈少兴%谭光宏%黎岳南%黄风迎%王华%黄用豪
陳少興%譚光宏%黎嶽南%黃風迎%王華%黃用豪
진소흥%담광굉%려악남%황풍영%왕화%황용호
组织因子%重组蛋白质%原核表达载体%小鼠
組織因子%重組蛋白質%原覈錶達載體%小鼠
조직인자%중조단백질%원핵표체재체%소서
Tissue factor%Recombinant protein%Prokaryotic expression vector%Mice
目的 体外扩增小鼠组织因子基因cDNA序列,构建小鼠组织因子重组原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达.方法 根据基因库提供的基因序列设计克隆扩增小鼠组织因子cDNA基因序列的引物,利用原位反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增获得小鼠组织因子cDNA基因,通过内切酶酶切和T7酶连接,将小鼠组织因子cDNA序列插入原核表达质粒pQE30多克隆位点中.筛选的重组质粒经酶切和DNA序列测定证实正确后,转染感受态大肠杆菌,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹法进行鉴定.结果 琼脂糖凝胶电泳发现扩增的小鼠组织因子cDNA序列相对分子量大小和预期值相一致,重组质粒酶切结果和预期值相符,DNA序列测定显示质粒的目的基因阅读框架准确无误.用IPTG诱导可以有效诱导重组蛋白质在大肠杆菌中表达,表达的重组蛋白质相对分子量与预期值相一致.结论 成功构建了小鼠组织因子的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导了有效表达,为将组织因子应用于治疗和功能研究奠定了基础.
目的 體外擴增小鼠組織因子基因cDNA序列,構建小鼠組織因子重組原覈錶達質粒,在大腸桿菌中誘導錶達.方法 根據基因庫提供的基因序列設計剋隆擴增小鼠組織因子cDNA基因序列的引物,利用原位反轉錄聚閤酶鏈式反應(RT-PCR)技術擴增穫得小鼠組織因子cDNA基因,通過內切酶酶切和T7酶連接,將小鼠組織因子cDNA序列插入原覈錶達質粒pQE30多剋隆位點中.篩選的重組質粒經酶切和DNA序列測定證實正確後,轉染感受態大腸桿菌,用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導錶達併通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡法進行鑒定.結果 瓊脂糖凝膠電泳髮現擴增的小鼠組織因子cDNA序列相對分子量大小和預期值相一緻,重組質粒酶切結果和預期值相符,DNA序列測定顯示質粒的目的基因閱讀框架準確無誤.用IPTG誘導可以有效誘導重組蛋白質在大腸桿菌中錶達,錶達的重組蛋白質相對分子量與預期值相一緻.結論 成功構建瞭小鼠組織因子的原覈錶達載體,併在大腸桿菌中誘導瞭有效錶達,為將組織因子應用于治療和功能研究奠定瞭基礎.
목적 체외확증소서조직인자기인cDNA서렬,구건소서조직인자중조원핵표체질립,재대장간균중유도표체.방법 근거기인고제공적기인서렬설계극륭확증소서조직인자cDNA기인서렬적인물,이용원위반전록취합매련식반응(RT-PCR)기술확증획득소서조직인자cDNA기인,통과내절매매절화T7매련접,장소서조직인자cDNA서렬삽입원핵표체질립pQE30다극륭위점중.사선적중조질립경매절화DNA서렬측정증실정학후,전염감수태대장간균,용이병기-β-D-류대반유당감(IPTG)유도표체병통과10%취병희선알응효전영(SDS-PAGE)화단백인적법진행감정.결과 경지당응효전영발현확증적소서조직인자cDNA서렬상대분자량대소화예기치상일치,중조질립매절결과화예기치상부,DNA서렬측정현시질립적목적기인열독광가준학무오.용IPTG유도가이유효유도중조단백질재대장간균중표체,표체적중조단백질상대분자량여예기치상일치.결론 성공구건료소서조직인자적원핵표체재체,병재대장간균중유도료유효표체,위장조직인자응용우치료화공능연구전정료기출.
Objective To construct a prokaryotic vector encoding murine tissue factor and to express the recombinant tissue factor protein.Methods The cDNAs of murine tissue factor were amplified from total RNAs of murine livers.The corresponding prokaryotic expression vectors were constructed by restrictive endonuclease digestion and ligation,and then the recombinant vectors pQE-mTF were proofed by restricting enzymatic digestion and DNA sequencing.The confirmed vectors were transfected into E.coli JM109 and recombinant protein expression was induced by Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG).Results The recombinant expression vectors of murein tissue factor(pQE-mTF)were constructed successfully.The recombinant murine tissue factor protein was expressed stably in E.coli JM109.Conclusion Recombinant murine tissue factor lays a solid foundation for applying tissue factors to treatment and further functional study.
