CAJ | 학술논문

目的:构建针对大鼠肝癌细胞的HSV-tk/GCV(以下简称tk/GCV系统)自杀基因治疗系统,建立比较tk/GCV系统作用效果及其旁观者效应大小的细胞模型和检测方法.方法:用包装细胞PT67/tk分泌的重组逆转录病毒的活性颗粒感染大鼠肝癌CBRH7919细胞,用G418筛选3 wk获得高耐药性的重组子CBRH7919/tk,扩大培养.提取CBRH7919(tk-),CBRH7919/tk(tk+)细胞的DNA,把HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后,与2种DNA及阳性对照DNA进行点杂交,以检测tk+细胞的DNA是否整合有HSV-tk基因.用0.1、1、10、50、100mg/L的GCV体外作用于tk-、tk+细胞,MTT检测存活率.用GCV体外分别作用于含不同比例tk+细胞的tk+、tk-混合细胞,MTT检测存活率,比较分析各组旁观者效应大小,确定后续实验的合适tk+比例.结果:用G418筛选3wk后获到高耐药性的CBRH7919/tk(tk+)重组细胞HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后进行点杂交,检测到tk+细胞DNA上已整合有HSV-tk基因,而tk-细胞DNA不合HSV-tk基因.GCV对tk+细胞生长抑制和细胞毒作用明显,而且有浓度、时间依赖性,而tk-细胞对GCV不敏感,说明HSV-tk基因已表达且表达产物具有生物学活性.GCV对含5%和10%tk+的混合细胞杀伤率分别为6.0%和25.2%,结果表明5-10%的tk+混合比例下自杀基因系统自身的旁观者效应较低,而且用MTT检测旁观者效应大小时灵敏度比较高,可作为后续研究中药活性成分对旁观者效应增效作用的tk+、tk-混合比例.结论:成功构建了针对大鼠肝癌的HSV1-tk/GCV自杀基因治疗系统,建立了体外快速筛选旁观者效应增效药物的稳定有效的细胞模型和检测方法.
목적:구건침대대서간암세포적HSV-tk/GCV(이하간칭tk/GCV계통)자살기인치료계통,건립비교tk/GCV계통작용효과급기방관자효응대소적세포모형화검측방법.방법:용포장세포PT67/tk분비적중조역전록병독적활성과립감염대서간암CBRH7919세포,용G418사선3 wk획득고내약성적중조자CBRH7919/tk,확대배양.제취CBRH7919(tk-),CBRH7919/tk(tk+)세포적DNA,파HSV-tk기인편단용Dig표기위탐침후,여2충DNA급양성대조DNA진행점잡교,이검측tk+세포적DNA시부정합유HSV-tk기인.용0.1、1、10、50、100mg/L적GCV체외작용우tk-、tk+세포,MTT검측존활솔.용GCV체외분별작용우함불동비례tk+세포적tk+、tk-혼합세포,MTT검측존활솔,비교분석각조방관자효응대소,학정후속실험적합괄tk+비례.결과:용G418사선3wk후획도고내약성적CBRH7919/tk(tk+)중조세포HSV-tk기인편단용Dig표기위탐침후진행점잡교,검측도tk+세포DNA상이정합유HSV-tk기인,이tk-세포DNA불합HSV-tk기인.GCV대tk+세포생장억제화세포독작용명현,이차유농도、시간의뢰성,이tk-세포대GCV불민감,설명HSV-tk기인이표체차표체산물구유생물학활성.GCV대함5%화10%tk+적혼합세포살상솔분별위6.0%화25.2%,결과표명5-10%적tk+혼합비례하자살기인계통자신적방관자효응교저,이차용MTT검측방관자효응대소시령민도비교고,가작위후속연구중약활성성분대방관자효응증효작용적tk+、tk-혼합비례.결론:성공구건료침대대서간암적HSV1-tk/GCV자살기인치료계통,건립료체외쾌속사선방관자효응증효약물적은정유효적세포모형화검측방법.