中国组织工程研究与临床康复
中國組織工程研究與臨床康複
중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2007年
23期
4461-4465
,共5页
张学荣%蒙怡%舒雨雁%韦敏%石庆秋%徐阳曦
張學榮%矇怡%舒雨雁%韋敏%石慶鞦%徐暘晞
장학영%몽이%서우안%위민%석경추%서양희
胎盘免疫调节因子%CIK细胞%超微结构%细胞表型
胎盤免疫調節因子%CIK細胞%超微結構%細胞錶型
태반면역조절인자%CIK세포%초미결구%세포표형
目的:通过电子显微镜、流式细胞仪观察经胎盘免疫调节因子处理的细胞因子诱导的杀伤细胞超微结构及免疫表型变化,了解胎盘免疫调节因子的免疫调节活性.方法:实验于2006-02/2007-01在广西医科大学医学科学实验中心重点实验室进行.实验材料:重组人干扰素γ和白细胞介素1α为Peprotech公司产品.重组人白细胞介素2和抗人CD3单克隆抗体为北京远策药业有限公司产品.实验方法:①胎盘免疫调节因子的制备:将新鲜经检人胎盘去筋膜,生理盐水冲净、剪碎匀浆,置-20 ℃ 48 h后,反复冻融3次,用生理盐水透析,取透析外液,过虑除菌,分装,抽样做有关鉴定实验.②细胞因子诱导的杀伤细胞的制备:抽取健康自愿者静脉血20 mL,用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,加RPMI1640培养液调整细胞的密度至1×109 L-1,放于50 mL培养瓶中培养.于当天加入1×106 U/L干扰素γ,置于37 ℃、50 mL/L CO2孵育箱中培养24 h.次日将悬浮的细胞转移到6孔板培养中,分别加入终浓度为100 mg/L的PHA、3×105 U/L白细胞介素2、133 μg/L抗CD3 mAb及1×105 U/L白细胞介素1α,每3 d半量换液1次,同时补加白细胞介素2至3×105 U/L.将培养14 d细胞因子诱导的杀伤细胞以5×109 L-1接种于24孔板,实验组中加入一定剂量的胎盘免疫调节因子诱导,对照组加入等量生理盐水,继续培养72 h.③实验评估:制备电镜标本,观察细胞超微结构.采用流式细胞术测定细胞因子诱导的杀伤细胞CD4+、CD8+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD25+、HLA-DR、CD3+CD56+、CD80+百分含量.结果:①细胞因子诱导的杀伤细胞表型分析:实验组CD4+、CD8+和CD3+CD4+明显低于对照组[实验组:(8.40±8.15)%,(33.10±4.61)%,(7.98±12.65%);对照组:(39.43±9.16)%,(58.90±11.35)%,(31.30±5.94)%,P＜0.05];实验组CD3+CD8+、CD25+表达明显高于对照组[实验组:(30.50±2.56)%,(24.8±6.31)%;对照组:(15.90±7.35)%,(0.56±0.21)%,P＜0.05].②透视电镜下观察细胞因子诱导的杀伤细胞超微结构特征:与对照组相比,实验组细胞因子诱导的杀伤细胞线粒体深染,溶酶体增加,异染色质比例增加,微绒毛肿胀及增长等.结论:胎盘免疫调节因子能促使细胞因子诱导的杀伤细胞超微结构及细胞表型发生明显变化:细胞因子诱导的杀伤细胞线粒体深染,溶酶体增加,异染色质比例增加,微绒毛肿胀增长,CD3+CD8+、CD25+细胞百分比升高,CD4+、CD8+和CD3+CD4+细胞百分比降低.
目的:通過電子顯微鏡、流式細胞儀觀察經胎盤免疫調節因子處理的細胞因子誘導的殺傷細胞超微結構及免疫錶型變化,瞭解胎盤免疫調節因子的免疫調節活性.方法:實驗于2006-02/2007-01在廣西醫科大學醫學科學實驗中心重點實驗室進行.實驗材料:重組人榦擾素γ和白細胞介素1α為Peprotech公司產品.重組人白細胞介素2和抗人CD3單剋隆抗體為北京遠策藥業有限公司產品.實驗方法:①胎盤免疫調節因子的製備:將新鮮經檢人胎盤去觔膜,生理鹽水遲淨、剪碎勻漿,置-20 ℃ 48 h後,反複凍融3次,用生理鹽水透析,取透析外液,過慮除菌,分裝,抽樣做有關鑒定實驗.②細胞因子誘導的殺傷細胞的製備:抽取健康自願者靜脈血20 mL,用淋巴細胞分離液分離外週血單箇覈細胞,加RPMI1640培養液調整細胞的密度至1×109 L-1,放于50 mL培養瓶中培養.于噹天加入1×106 U/L榦擾素γ,置于37 ℃、50 mL/L CO2孵育箱中培養24 h.次日將懸浮的細胞轉移到6孔闆培養中,分彆加入終濃度為100 mg/L的PHA、3×105 U/L白細胞介素2、133 μg/L抗CD3 mAb及1×105 U/L白細胞介素1α,每3 d半量換液1次,同時補加白細胞介素2至3×105 U/L.將培養14 d細胞因子誘導的殺傷細胞以5×109 L-1接種于24孔闆,實驗組中加入一定劑量的胎盤免疫調節因子誘導,對照組加入等量生理鹽水,繼續培養72 h.③實驗評估:製備電鏡標本,觀察細胞超微結構.採用流式細胞術測定細胞因子誘導的殺傷細胞CD4+、CD8+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD25+、HLA-DR、CD3+CD56+、CD80+百分含量.結果:①細胞因子誘導的殺傷細胞錶型分析:實驗組CD4+、CD8+和CD3+CD4+明顯低于對照組[實驗組:(8.40±8.15)%,(33.10±4.61)%,(7.98±12.65%);對照組:(39.43±9.16)%,(58.90±11.35)%,(31.30±5.94)%,P＜0.05];實驗組CD3+CD8+、CD25+錶達明顯高于對照組[實驗組:(30.50±2.56)%,(24.8±6.31)%;對照組:(15.90±7.35)%,(0.56±0.21)%,P＜0.05].②透視電鏡下觀察細胞因子誘導的殺傷細胞超微結構特徵:與對照組相比,實驗組細胞因子誘導的殺傷細胞線粒體深染,溶酶體增加,異染色質比例增加,微絨毛腫脹及增長等.結論:胎盤免疫調節因子能促使細胞因子誘導的殺傷細胞超微結構及細胞錶型髮生明顯變化:細胞因子誘導的殺傷細胞線粒體深染,溶酶體增加,異染色質比例增加,微絨毛腫脹增長,CD3+CD8+、CD25+細胞百分比升高,CD4+、CD8+和CD3+CD4+細胞百分比降低.
목적:통과전자현미경、류식세포의관찰경태반면역조절인자처리적세포인자유도적살상세포초미결구급면역표형변화,료해태반면역조절인자적면역조절활성.방법:실험우2006-02/2007-01재엄서의과대학의학과학실험중심중점실험실진행.실험재료:중조인간우소γ화백세포개소1α위Peprotech공사산품.중조인백세포개소2화항인CD3단극륭항체위북경원책약업유한공사산품.실험방법:①태반면역조절인자적제비:장신선경검인태반거근막,생리염수충정、전쇄균장,치-20 ℃ 48 h후,반복동융3차,용생리염수투석,취투석외액,과필제균,분장,추양주유관감정실험.②세포인자유도적살상세포적제비:추취건강자원자정맥혈20 mL,용림파세포분리액분리외주혈단개핵세포,가RPMI1640배양액조정세포적밀도지1×109 L-1,방우50 mL배양병중배양.우당천가입1×106 U/L간우소γ,치우37 ℃、50 mL/L CO2부육상중배양24 h.차일장현부적세포전이도6공판배양중,분별가입종농도위100 mg/L적PHA、3×105 U/L백세포개소2、133 μg/L항CD3 mAb급1×105 U/L백세포개소1α,매3 d반량환액1차,동시보가백세포개소2지3×105 U/L.장배양14 d세포인자유도적살상세포이5×109 L-1접충우24공판,실험조중가입일정제량적태반면역조절인자유도,대조조가입등량생리염수,계속배양72 h.③실험평고:제비전경표본,관찰세포초미결구.채용류식세포술측정세포인자유도적살상세포CD4+、CD8+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD25+、HLA-DR、CD3+CD56+、CD80+백분함량.결과:①세포인자유도적살상세포표형분석:실험조CD4+、CD8+화CD3+CD4+명현저우대조조[실험조:(8.40±8.15)%,(33.10±4.61)%,(7.98±12.65%);대조조:(39.43±9.16)%,(58.90±11.35)%,(31.30±5.94)%,P＜0.05];실험조CD3+CD8+、CD25+표체명현고우대조조[실험조:(30.50±2.56)%,(24.8±6.31)%;대조조:(15.90±7.35)%,(0.56±0.21)%,P＜0.05].②투시전경하관찰세포인자유도적살상세포초미결구특정:여대조조상비,실험조세포인자유도적살상세포선립체심염,용매체증가,이염색질비례증가,미융모종창급증장등.결론:태반면역조절인자능촉사세포인자유도적살상세포초미결구급세포표형발생명현변화:세포인자유도적살상세포선립체심염,용매체증가,이염색질비례증가,미융모종창증장,CD3+CD8+、CD25+세포백분비승고,CD4+、CD8+화CD3+CD4+세포백분비강저.
